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霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病,是世界七大流行病之一,为我国甲类法定传染病,具有发病急、传播快、波及面广等特点,危害极其严重。自1817年发现霍乱以来,已发生过7次世界性的大流行,因此其预防和控制受到各国政府的高度重视。预防霍乱发生的有效方式除了有赖于安全水源和提高卫生条件外,更为重要的是发展廉价实用的霍乱疫苗。现有疫苗费用昂贵,贮存、运输相当困难,因此,研制成本低、使用简单、易于贮存运输的新疫苗是疫苗研究的一大热点。
植物基因工程技术的不断成熟为新型疫苗的研究提供了新的思路。转基因植物产生的疫苗,可由人体简单摄食含该种疫苗的植物组织,通过刺激机体黏膜的特异性免疫应答,使人体获得较持久的疾病防御能力。由于成本低廉、无需冷藏、无需一次性针头、使用方便,因此,“植物口服疫苗”得到了世界卫生组织(WHO)的提倡,开展这方面的研究对推动全球免疫计划的实施具有重要的意义。
本研究利用植物DNA重组技术,以胡萝卜下胚轴为受体材料,采用农杆菌介导法将霍乱毒素B亚单位基因(CTB)导入到胡萝卜中,得到了转CTB基因的T0代植株110棵,通过穴盘播种T1代种子得到T1代植株172棵。分别用通用引物和特异引物,对获得的卡那霉素抗性植株进行了PCR检测筛选。110株T0代植株中引物n1/n2检测出90株为阳性,阳性率达到81.8%,p1/p2和c1/c2检测阳性率分别为72.7%和34.5%;相应的T1代植株n1/n2、p1/p2、c1/c2检出阳性率最高分别为88.6%,74.3%,31.4%,遗传稳定性较好。
采用ELISA法对转基因植株中CTB表达水平进行了检测,结果表明导入的CTB基因在转基因胡萝卜中的整体表达水平不高,活性CTB含量最高为2.959 μg/g·FW,但在部分转基因植株中不表达;在转基因植株中,CTB表达存在器官特异性,在叶片和块根中均有特异性的表达,且叶片表达量较块根高,而在茎中却不表达。
进一步采用Western杂交对ELISA检测过的转基因胡萝卜的基因表达水平进行了分析,验证了转霍乱毒素B基因胡萝卜体内表达的CTB蛋白的存在,结果证实转基因胡萝卜中CTB可与抗体特异性结合,且复性后目的蛋白以五聚体的形式表达,这为进一步的动物试验研究打下了基础。