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猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的猪的高度接触性、致死性传染性疾病，给养猪业造成巨大威胁和经济损失。本研究建立了CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交检测方法；并采用建立的CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交方法初步应用于CSFV RNA在体外感染细胞中的增殖动态研究和体内感染组织的CSFVRNA检测。为了高效检测和准确定位CSFV并探究CSFV RNA在体外感染细胞中的复制动态和分布规律，本研究分别设计并合成了CSFV RNA和猪内参基因β-actin的多条特异性探针，对培养于PK15细胞系中的CSFV中等致病力毒株HeBHH1/95（TCID-.550为104/200μL）进行研究。并采用正交试验方法优化反应条件，根据检测结果、荧光强度、重复性等因素，确定CSFV QuantiGeneViewRNA原位杂交反应的关键要素，蛋白酶K最优浓度为1:1000，甲醛最优固定时间为30min。在荧光共聚焦显微镜下，阳性样本可检测到明亮的红色荧光。通过与CSFV免疫组化法及CSFV单抗免疫荧光法比较，该法检测灵敏度可达10-8，分别比CSFV免疫组化法及CSFV单抗免疫荧光法高4个和3个数量级；同时，采用不同亚型CSFV毒株和猪其它相关病毒质控样本验证其特异性，能特异性与各种亚型的CSFV结合，与其他病毒无交叉反应，显示了良好的特异性。为了研究CSFV RNA在体外感染细胞中的准确定位和增殖动态规律，本研究采用中等致病力流行毒株HeBHH1/95株和HCLV分别接种体外培养细胞PK15，用上述建立的CSFV QuantiGeneViewRNA原位杂交方法分别对0.5hpi、1hpi、1.5hpi、2hpi、2.5hpi、3hpi、3.5hpi、4hpi、4.5hpi、5hpi、5.5hpi、6hpi、12hpi、18hpi、24hpi、36hpi、48hpi、72hpi、96hpi的感染细胞进行检测，荧光共聚焦显微镜下观察。结果显示，HeBHH1/95和HCLV感染PK15细胞后，随着感染时间的延长，能观察到病毒在细胞内持续增长繁殖，72hpi达到最高值，直到96hpi病毒RNA一直保持较高水平；；感染后0.5hpi，便可在细胞内检测到病毒RNA，且0.5hpi~12hpi之间，病毒RNA集中在细胞核内，18hpi以后，病毒RNA主要集中于细胞核周围的细胞质中直到96hpi；流行毒株和疫苗毒株RNA的复制规律是一致的。本研究第一次从RNA分子角度阐明了CSFV流行毒株和疫苗毒株在体外培养细胞中的增殖动态和RNA的复制规律。为了准确可视化检测体内感染细胞中的CSFV RNA，本研究采集了CSFV感染动物的扁桃体、肠道和肾脏样本制成石蜡包埋组织切片（FFPE），使用QuantiGene ViewRNA原位杂交技术对感染后各器官靶细胞中CSFV RNA进行精确检测。结果显示，在荧光显微镜下可观察到点状红色荧光信号，说明建立的CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交方法能准确、可视化地对石蜡包埋组织切片中CSFV RNA进行检测。该研究可为探索CSFV感染靶细胞类型的差异，分析CSFVRNA复制动态、分布变化与病程、病理损伤之间的相关性提供重要的技术平台。本研究成功建立了CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交检测方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和省时的优点，为CSFV准确诊断提供了一种高敏感且特异的新技术；同时为CSFV RNA在体内外靶细胞中增殖动态和RNA的复制规律研究提供重要的技术支持；还可对临床采集CSFV RNA富集样品提出指导意见。