目的:神经胶质瘤(Gliolma)是神经系统中最常见的恶性肿瘤,它起源于神经组织中的神经胶质细胞,神经胶质瘤是一种癌细胞起源、病理结构、生物学特征和临床症状都很特殊的肿瘤,其恶性程度高且术后易复发,目前采用的手术、化疗、放疗三大常规治疗措施的效果均不理想,原因在于上述方法属减数性治疗,无法彻底清除残留细胞。人们关注着开拓新的治疗途径,在免疫治疗中,肿瘤单抗和肿瘤疫苗是当今研究的热点,其核心是找到肿瘤的特异抗原或相关抗原,目前,虽然还未发现胶质瘤特异抗原,但胶质瘤相关抗原的存在已得到人们的确认,这类抗原为胶质瘤细胞表面所特有。80年代早期开始,利用杂交瘤技术,将人脑胶质瘤培养细胞系LN-18和SHG-44作为抗原免疫小鼠,通过细胞融合,克隆化培养后获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。抗胶质瘤单克隆抗体被应用于胶质瘤实验研究和诊断治疗以及胶质瘤细胞抗原的分析,因其效价高,特异性好的优势,在胶质瘤的免疫生物学以及免疫治疗方面取得了突破性的进展。本实验利用人神经胶质瘤细胞系(SKN-SH)作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合、克隆化培养,旨在建立新的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体的生物学特性尚有待于研究,可能为神经胶质瘤的诊断及治疗提供新的制剂,并为基因工程抗体的研究奠定基础。方法:1.抗原的制备传代培养的肿瘤细胞是较常用的一种抗原,其优点是细胞单一,易于获得,实验方便及便于重复。本实验采用SKN-SH细胞作为抗原,这种颗粒性的抗原具有较强的免疫原性,可以不加佐剂,直接免疫小鼠。2.免疫方案常用的免疫途径包括皮下、静脉、腹腔和肌肉注射。本实验采用腹腔注射免疫,其是刺激脾的最佳方法。收集SKN-SH细胞6×107,离心洗涤,经腹腔注射进行初次免疫,间隔1周后,再取同量细胞追加免疫3次,每次间隔1周。末次加强免疫后3d取小鼠脾细胞进行融合为最佳时机。3.小鼠骨髓瘤细胞系(SP2/0)细胞的准备为避免细胞出现返祖现象,应用含8-AG的培养液进行诱导,增加对HAT的敏感性,有利于融合率的提高,使用浓度为20μg/ml,诱导1个月后,改用含10%胎牛血清的RPMI 1640(以下简称1640)培养液传代培养,选择对数生长期的细胞进行融合。4.细胞融合取已免疫的小鼠脾脏,收集脾细胞,分别吸取1×10~8个脾细胞与4×10~7个SP2/0骨髓瘤细胞按2:1进行融合,通过HAT选择性培养,使杂交瘤细胞增殖并形成克隆。5.ELISA检测融合后10d,细胞克隆长大约占孔底面积的1/3～1/2,每个孔内含1个或几个克隆。此时应在末次换液后2d内及时对细胞克隆的培养上清做ELISA检测。首先裂解SKN-SH细胞提取蛋白质做阳性抗原包被96孔板,SP2/0细胞培养上清做阴性对照包被96孔板,杂交瘤细胞培养上清作为一抗进行ELISA检测,然后筛选出分泌特异性单克隆抗体的阳性孔。6.克隆化培养由于融合初期形成的杂交瘤细胞不稳定,染色体易丢失,因此细胞克隆一经检测为分泌抗体的阳性克隆,就应及时进行克隆化培养。本实验采用有限稀释法克隆化培养,该法操作简便,不需特殊设备,是最常用的方法。其原理是将细胞悬液进行系列稀释,为确保出现单个克隆,每次克隆应稀释为3种细胞浓度,即5个/ml、10个/ml、30个/ml,然后每孔加100μl,理论上计算每个孔分别含0.5个、1个和3个细胞,一般总能得到单克隆孔。经过3次的克隆化培养,直至细胞克隆分泌抗体的阳性率达100%,将杂交瘤细胞予以冻存。7.腹水的收集将杂交瘤细胞大量传代培养后,收集细胞并接种于经降脂烷预处理的BALB/c小鼠腹腔,14d后收集含单抗的腹水。8.复苏杂交瘤细胞由于杂交瘤细胞不宜在体外长期培养,防止变异丢失,冻存的细胞应每隔1～2年复苏出来,检测抗体分泌情况,必要时再进行克隆化培养。结果:1.经HAT选择性培养后,74孔出现由数个细胞组成的集落,即细胞克隆;2.对形成细胞克隆的孔进行ELISA检测,筛选出24个分泌特异性抗体的阳性孔;3.从抗体分泌阳性的孔中筛选出3个强阳性孔进行克隆化培养,3次克隆培养后,分泌抗体阳性率达100%;4.杂交瘤细胞经小鼠腹腔注射后,获得含大量单抗的腹水10ml。结论:本研究通过杂交瘤细胞融合技术,成功地制备了1株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,可能为脑胶质瘤的诊断和治疗提供了新的制剂,同时为基因工程抗体的研究奠定基础。