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背景恶性肿瘤是危害人类健康的最重要疾病之一,对人类的生存造成了极大的危害。近年来,肿瘤的治疗尽管在手术、放疗和化疗等方面取得了很大的进步,但仍然存在着治愈率低、复发率高和药物副作用大等问题。过继免疫治疗（a doptive immunotherapy,AIT）是恶性肿瘤生物治疗的重要方法之一,通过嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）修饰T细胞的肿瘤过继免疫治疗,是近年来研究的热点,能够重塑T细胞的靶向性、增殖性和持久性,有效地提高其特异杀伤活性[1-2]。基因转导有许多种方法,例如,γ逆转录病毒载体（Gamma retrovirus,γRV）、腺相关病毒载体、慢病毒载体、转座子及mRNA电穿孔等[3-4]。目前常用的T细胞基因转导方法是慢病毒、逆转录病毒转染,但其除了转染效率有限之外,逆转录病毒的整合和插入突变可能会产生基因毒性,让人们对它在临床上的应用存在一些担忧[5-6]。本研究所用的非病毒PiggyBac转座子系统可以通过“切离-粘贴”机制,特异的插入到“TTAA”四碱基位点整合基因,来达到外源基因长期表达的目的[7]。有实验证明,PiggyBac（PB）转座子,可以成功对人类T细胞进行稳定基因修饰,从而提高T细胞在体内外对肿瘤的杀伤能力[8]。本研究致力于建立一种基于PiggyBac转座子构建CAR-T细胞的策略,对T细胞进行稳定的基因改造,建立体外激活扩增体系,实现CAR-T细胞优势扩增及CAR在T细胞中的高表达,并保留记忆表型的CAR-T细胞。目的建立一种非病毒的T细胞基因转导及体外激活扩增系统,为CAR-T细胞免疫治疗提供实验基础。方法将CD19CAR表达框（1470bp）克隆入PiggyBac转座子载体PB513B-1的XbaI和EcoRI位点,构建靶向CD19的PiggyBac转座子载体（pb19CAR）;DNA酶切电泳、基因测序确认载体构建成功,Western blot检测T细胞中CD19CAR的表达。将pb19CAR转座子和转座酶双质粒,或pb19CAR转座子单质粒经电穿孔仪（1×20ms 830V/840V/850V）和核转仪（U014/T023）转导外周血单个核细胞（PBMC）,优化转导程序,比较两种转导装置的转导效率及细胞存活率,并与传统的慢病毒转染方法作对比。用靶抗原CD19蛋白（5μg/ml）和CD3/CD28mAb（5μg/ml）两种包被平板激活、IL-2（500U/ml）和混合细胞因子IL-7（10ng/ml）/IL-15（10ng/ml）/IL-21（20ng/ml）两种扩增方法,比较激活、扩增、CD19CAR表达和CAR-T细胞表型。结果PiggyBac转座子重组载体（pb19CAR）经XbaI和EcoRI双酶切后DNA凝胶电泳和基因测序确认构建成功;Western blot检测结果表明嵌合抗原受体CD19CAR在CAR-T细胞中成功表达。经流式细胞术及细胞活力计数仪检测,电穿孔仪转导效率及细胞活率均高于核转仪（53.2±2.7%和33.5±1.7%,75±3.8%和60±3.0%,均P<0.05）;电穿孔仪、核转仪转导效率高于慢病毒转染（25.9±1.3%）,而细胞活率低于慢病毒转染（80±2.8%）。电穿孔后激活、扩增培养12天,流式细胞术检测细胞表面CD19CAR表达显示:靶抗原CD19蛋白组明显高于CD3/CD28mAb组（72.5±3.6%和53.7±2.7%,P<0.05）;流式细胞术细胞表型分析显示:混合细胞因子组（IL-7/IL-15/IL-21）比IL-2组有更高比例的Tscm/Tscm-like（24.7±1.2%和12.1±0.6%,P<0.05）、Tcm细胞（10.2±0.5%vs2.9±0.1%,P<0.05）。结论1.本研究测试了Celetrix电穿孔仪,Lonza核转仪及传统的慢病毒转染,以Celetrix电穿孔仪的转导效率、细胞活率、转染后细胞活化为佳。并且PiggyBac转座酶对外源目的基因的转座、稳定表达是不可或缺的。2.靶抗原CD19蛋白激活组CAR-T细胞的CD19CAR表达率明显高于CD3/CD28mAb激活组,表明靶抗原CD19蛋白刺激可优势扩增靶向CD19的CAR-T细胞。3.混合细胞因子（IL-7/IL-15/IL-21）支持具有中央记忆和干细胞记忆表型的CAR-T细胞生长。本研究为CAR-T细胞免疫治疗提供实验基础。