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结直肠癌是常见的恶性肿瘤,在西方国家,结直肠癌是导致癌症死亡的第三位肿瘤。我国的饮食习惯正在不断改变,饮食中纤维素的含量下降将可能提高结直肠癌的发病率。此外,我国的肿瘤筛查和标准化治疗等程序不如西方国家规范,结直肠癌正在严重威胁着人们的健康。然而肿瘤是一个多因素多步骤的发病机制,迄今为止,多种癌基因及抑癌基因的发现和提出部分阐明了肿瘤的机制。并且这些研究结果将有望成为今后治疗肿瘤的新方向。MYBL2基因,又称B-MYB,广泛地表达于增殖的细胞,MYBL2具有多种的作用,首先,它维持正常的细胞周期进程。其次,MYBL2通过多个途径抑制细胞的凋亡。此外,MYBL2还与细胞衰老相关。有研究表明,MYBL2还与干细胞样表型有关。MYBL2还可以维持多能干细胞的特性,如维持自我更新性和分化等。MYBL2在多种肿瘤中呈过表达,并与肿瘤的发生发展相关,并且MYBL2的表达水平还与肿瘤患者的预后相关。因此,MYBL2在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。目前,关于MYBL2在结直肠癌中的研究报道较少,主要缺乏MYBL2在结直肠癌组织中mRNA水平和蛋白水平方面的研究,也没有建立其与结直肠癌患者预后的关系,此外,在该基因功能学的研究也只是集中在细胞周期相关方面,而MYBL2是否在结直肠癌中还具有其他的相关功能,这也将是本研究需要探讨的。本研究将分成三个部分进行阐述：第一部分MYBL2基因在结直肠癌和癌旁组织的表达差异以及与临床病理特征和预后的关系目的：本研究通过RT-PCR的方法检测结直肠癌组织和正常肠上皮组织的MYBL2mRNA表达情况,研究MYBL2基因在结直肠癌和止常组织的表达差异,并且探究MYBL2基因与结直肠癌患者临床病理特征以及预后的关系。方法：收集2007年至2009年在复旦大学附属肿瘤医院组织库保存的结直肠癌RNA later标本,其中有70对病例用于检测癌与癌旁组织mRNA表达量,另180例肠癌组织用于研究MYBL2表达量与临床病理特征和无病生存期(DFS)的关系。正常肠组织与结直肠癌组织mRNA表达差异用配对T检验,肠癌组织中mRNA表达量与临床病例特征之间的关系用T检验和方差分析,用Kaplan-Meier法计算两组的预后和绘制生存曲线,并用Log rank法进行单因素分析,计算生存曲线之间的差异,通过COX回归模型进行多因素分析。结果：在癌组织中,MYBL2的]mRNA表达量明显高于正常组织(P=0.016),这提示了MYBL2基因可能与结直肠癌的发生有关。MYBL2基因表达量与结直肠癌的肿瘤大小、肿瘤分期和淋巴结转移等方面相关。肿瘤最大径>5cm组的MYBL2mRNA表达量高于<5cm组的患者(P=0.048)。III期患者的表达量高于II期患者(P=0.014)。有淋巴结转移组的表达量高于无淋巴结转移组(P=0.014),并且,MYBL2基因的表达量与N的分期呈正相关,N分期越高,表达量越高(P=0.049)。MYBL2和患者的复发转移相关,复发转移组的MYBL2基因表达量显著高于无复发转移组(P=0.037)。MYBL2基因表达量还与结直肠癌患者的无病生存呈负相关(P=0.017),即MYBL2的mRNA水平越高,患者的无病生存越差。MYBL2的mRNA表达量是影响结直肠癌DFS的独立预后因素。第二部分MYBL2蛋白在结直肠癌和癌旁组织的表达差异以及与临床病理特征和预后的关系目的：目前为止MYBL2的蛋白水平在结直肠癌的表达情况未有报道,在组织中,个基因的mRNA水平和蛋白的表达水平不一定完全一致,因此,在检测MYBL2的mRNA水平时,检测其在结直肠癌中的蛋白表达水平也尤为重要。此外,免疫组化的检测方便可行,更广泛适用于临床诊断。在本部分中,我们将用免疫组化的方法进一步研究MYBL2的蛋白在结直肠中的表达情况,探讨其蛋白水平在结直肠癌预后是否仍具有显著意义。方法：收集2005年至2007年在复旦大学附属肿瘤医院行结直肠癌手术患者石蜡标本,制成组织芯片待检,其中癌组织标本共97例,为结直肠癌原发灶,正常肠组织标本104例。蛋白表达量与临床病理特征之间的关系用卡方检验,用Kaplan-Meier法计算和绘制生存曲线,并用Log rank法进行单因素分析,计算生存曲线之间的差异,通过COX回归模型进行多因素分析。结果：MYBL2蛋白主要表达在细胞浆和细胞核中。结直肠癌组织中的MYBL2蛋白的高表达率远远高于正常肠上皮的高表达率。MYBL2蛋白表达与临床病理特征关系的分析显示,MYBL2蛋白表达量与患者的性别、年龄、分化程度、大体类型、肿瘤大小、部位和TNM分期无明显关系。但是,复发转移组的高表达率(93.75%)高于无复发转移组(70.77%),并具有统计学意义(P=0.010)。MYBL2蛋白表达与结直肠癌患者预后相关,高表达MYBL2蛋白比低表达者具有更差的DFS(P<0.05)。通过对结直肠癌预后的COX多因素回归分析,MYBL2蛋白和肿瘤分期是结直肠癌的独立预后因子。第三部分 MYBL2基因在结肠癌中机制的初步探讨目的：MYBL2基因可能参与了结直肠癌肿瘤的发生发展,它可能影响肿瘤的增殖、侵袭或转移。现有报道显示,MYBL2基因在细胞增殖中起着重要的作用,并且还参与细胞周期的调控。因此,本部分将进一步研究MYBL2基因对结肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响,探讨其可能的机制。方法：运用RT-PCR法及western blot法检测各肠癌细胞株中的MYBL2基因和蛋白表达量。选择高表达的SW480结肠癌细胞株,用siRNA干扰MYBL2的表达。用CCK8法检测干扰组和对照组间的增殖差异,用流式法检测细胞周期和细胞凋亡,用划痕实验以及transwell小室实验检测MYBL2对细胞迁移的影响,最后,用western blot法检测干扰组和对照组与侵袭、周期、凋亡相关蛋白的变化情况。结果：当MYBL2的siRNA成功干扰结肠癌细胞株SW480后,通过CCK8细胞增殖实验发现,MYBL2可以促进结肠癌细胞的增殖。通过对细胞周期的研究发现,干扰MYBL2基因将使细胞停滞在G2期,阻止细胞周期的进程。此外,干扰MYBL2基因的表达将促进细胞的凋亡。这提示了MYBL2可能通过调控细胞周期和细胞凋亡等机制促进结肠癌的增殖。细胞划痕和Transwell、室实验均显示MYBL2基因促进细胞的迁移能力,MYBL2基因表达影响结肠癌细胞中MMP9、Vimentin、E-cadherin侵袭相关蛋白,提示MYBL2可能促进细胞的侵袭,但具体的作用机制需要进一步实验进行研究。