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一、目的: 有丝分裂纺锤体检验点基因(The mitotic spindle assembly checkpoint,SAC)是在细胞分裂周期中保证子代细胞能够正确获得遗传物质的重要机制之一。其中,纺锤体检查点基因编码的蛋白(Mitotic arrest deficient2)MAD2对有丝分裂中纺锤体运动起监控作用。一旦MAD2蛋白在结构和功能上发生异常,分裂异常的子代细胞未发生凋亡而继续增殖,最终导致癌变。目前报道显示MAD2β蛋白是mad2基因的选择性剪切体。MAD2β在胃癌耐药中起作用,但其具体机制仍未阐明。本研究采用多种生物化学与分子生物学方法,初步探索和揭示MAD2β蛋白在胃癌耐药中的作用。 二、实验方法: 1.首先通过浓度递增法构建耐药细胞株SGC-7901/VCR,构建后验证是否构建成功,并检测其特有的耐药生物学特性。2.使用荧光实时定量PCR和蛋白免疫印迹筛选耐药细胞中具有显著差异表达的耐药可能基因。3.针对筛选出来的基因MAD2β,构建过表达的慢病毒后转染细胞,并筛选出MAD2β高表达的稳转株。4.通过细胞功能实验检测各组细胞的生物学特性并在RNA和蛋白水平验证是否构建成功。5. IC50(half maximal inhibitory concentration)法检测各组细胞的耐药性。6.荧光定量PCR(Real-time fluorescence quota PCR)和蛋白免疫印迹法研究MAD2β上游磷脂肌醇3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称AKT)-雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR,PI3K/AKT/mTOR)信号通路和下游效应蛋白TTK(monopolar spindle)、Bubr1(budding uninbibited by benzimidazole1)、Cdc20(cell division cycle20 homolog)、Chk1、Cyclin B1(cell cycle protein B1)和Aurora B的表达情况。7.不同临床分期胃癌组织标本中检验MAD2β上下游各蛋白的表达水平。 三、实验结果: 1.根据IC50值和RI值显示耐药株SGC-7901/VCR构建成功,其生长速率较亲本株下降,细胞周期主要分布在G0/G1期,且细胞形态变圆,失去多形性。2.荧光定量PCR和蛋白免疫印迹筛选发现MAD2β在耐药株表达差异(具有统计学意义)。3.过表达MAD2β能够增强AGS和MKN-45细胞的增殖和生长能力,且细胞周期主要分布在G0期和G1期。该表型与周期变化与相关调控蛋白Cyclin B1、Survivin、 c-Myc、 p27和caspase-3表达水平相一致。4. MAD2β高表达组在侵袭和迁移能力上较对照组增强,且其细胞呈现出多形性和不规则形态。上述表型变化也与相应的FAK、PYK2、paxillin和VE-cadherin蛋白表达水平相符。5.荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光分别在mRNA、蛋白和荧光水平上验证MAD2β过表达组构建成功。6. IC50检测发现过表达组耐药性显著增强。7.机制分析发现过表达MAD2β时,上游PI3K/AKT/mTOR信号通路激活,且其下游效应蛋白Bubr1和Aurora B表达明显上调。8.不同临床分期胃癌组织中,MAD2β上游和下游蛋白表达趋势与细胞中的表达水平相符。 四、结论: MAD2β在胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR中表达差异显著。过表达MAD2β使胃癌细胞株AGS和MKN-45耐药性增强,其增殖、侵袭和迁移能力亦提高。耐药机制中,上游PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活可能调控MAD2β的表达上调。表达增强的MAD2β又进一步调控下游效应蛋白Bubr1和Aurora B表达升高,从而促进胃癌细胞对多种化疗药物形成耐受性。MAD2β在上游信号通路和下游效应蛋白中起链接作用,最终下调胃癌细胞的药物敏感性。