胶质母细胞瘤（GBM）在胶质瘤中恶性程度最高,5年生存率极低,不足5%,患者的平均生存时间约为14个月。目前的治疗方式主要以手术切除辅以放疗和烷基化剂（如替莫唑胺）化疗为主,但由于胶质母细胞瘤具有高度侵袭性生长的特性且常常发生化疗药物耐药使其难以治愈,整体治疗效果欠佳。临床上,大约90%的患者分子分型诊断为IDH1/2野生型,这一类患者多数无胶质瘤病史,属于原发性GBM。另外大约10%的患者分子分型存在IDH1/2突变,且多数伴有低级别胶质瘤病史,属于继发性的胶质母细胞瘤。IDH 1/2突变的GBM患者对替莫唑胺的治疗敏感,预后明显优于IDH 1/2野生型的患者。TCGA数据库公布了胶质母细胞瘤的遗传基因和转录组图谱,将GBM分为四种分子亚型:经典型、间充质型、神经型和前神经型。这些不同的分子亚型在胶质母细胞瘤的临床治疗和预后方面均对应着不同的生存时间和不同的治疗反应。鉴于胶质母细胞瘤在临床上的治疗难度,积极地寻找新的、有效的治疗方式是目前临床亟待解决的问题。铁死亡是一种新发现的细胞死亡形式,由铁过载引起的脂质过氧化物累积为特点,它不同于凋亡或坏死,主要通过阻断systerm xc-或抑制谷胱甘肽依赖的抗氧化酶GPX4触发。Systerm xc-是由轻链SLC7A11和重链SLC3A2组成的跨膜二聚体复合物,将胱氨酸转运进入细胞,并被还原成半胱氨酸用于合成GSH,GSH被GPX4利用,将脂质过氧化物还原为脂质醇,研究认为铁死亡可能是由GSH-GPX4抗氧化系统的破坏引起的。铁有两种状态:亚铁(Fe2+)或铁(Fe3+),正常的铁代谢和体内平衡可以保护细胞免于发生铁死亡,铁氧化还原循环可能影响细胞对铁死亡的敏感性。主要利用Fe3+与血清中的转铁蛋白（TF）结合,通过细胞膜上的转铁蛋白受体（TFRC和TFR2）被细胞吸收。入胞后,胞质铁储存在铁蛋白中,由铁蛋白轻链（FTL）和铁蛋白重链1（FTH1）组成。目前已知有四类铁死亡诱导剂（FINs）可通过不同的机制诱导铁死亡。I类（如Erastin和sorafenib）抑制systerm xc-的活性并消耗GSH。Erastin通过抑制SLC7A11对胱氨酸的摄取来降低GSH的合成,从而导致活性氧（ROS）的积累引发铁死亡。细胞中GSH含量的降低还可以抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的活性,导致细胞抗氧化能力下降,脂质活性氧增加,最终导致铁死亡。II类铁死亡诱导剂（如RSL3）可以直接抑制GPX4的活性。III类（如FIN56或他汀类药物）可诱导GPX4的降解,并干扰甲羟戊酸途径中间体的产生,包括辅酶Q10（COQ10）。IV类（如FINO2）可刺激脂质过氧化和GPX4活性的丧失。综上所述,GPX4是铁死亡的核心靶点。铁死亡在肿瘤的发生和抗肿瘤药物的耐药过程中起着重要的作用。文献报道铁代谢相关基因参与了TMZ耐药,靶向SLC7A11可促进TMZ在胶质瘤细胞中的抑制作用。值得注意的是,以往的报道主要集中在I型FINs（erastin）,而II型FINs（RSL3）对GBM细胞的影响尚未在转录组水平上阐明。此外,与铁死亡和TMZ耐药相关的病理生物标志物仍未发现。因此,在本研究中,通过体外和体内模型以及转录组的分析描述了RSL3对GBM细胞的抑制作用。揭示了基因FTH1和FTL作为潜在的生物标志物与GPX4的表达和胶质瘤的恶性表型密切相关。全文我们从6个方面来阐述:1.RSL3能有效抑制GBM细胞的增殖和迁移能力首先,本研究评估了RSL3对GBM细胞株的影响,通过增殖、伤痕愈合及Transwell小室侵袭实验发现RSL3能显著抑制胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭的能力。WB实验结果也证实了RSL3不影响凋亡标记物cleaved caspase 3蛋白的表达。为了研究下游基因网络,通过转录组m RNA测序来分析对照组和RSL3处理的LN18、原代GBM1细胞。并对测序数据进行分析,发现显著下调2倍以上的基因参与了细胞周期和细胞外基质的相互作用,而上调2倍以上的基因在炎症和缺氧相关基因集中富集。GSEA数据库富集分析发现,RSL3处理显著富集了铁死亡相关的基因集。此外,下调的基因显著富集了与细胞移动性和细胞增殖相关的基因集,包括上皮-间质转化（EMT）、侵袭性生长和转移等相关基因集。EMT被证实与细胞移动性相关,为验证测序结果,在LN18、LN229和GBM1细胞系中检测了部分EMT标志物,数据证实,RSL3处理后,N-Cadherin、Vimentin和EMT相关转录因子均表达变化,提示RSL3能抑制胶质母细胞瘤细胞的增殖和迁移等能力。2.RSL3和TMZ联合使用可显著降低GBM细胞的活力和迁移能力文献报道铁死亡可能参与了GBM细胞对TMZ的耐药,我们想进一步证实RSL3与TMZ联合作用对GBM细胞的影响。增殖实验的结果显示RSL3可以促进GBM细胞对TMZ敏感。Transwell实验也证明,RSL3和TMZ联合使用比单独使用RSL3或TMZ更能抑制GBM细胞的侵袭。为了准确检测铁死亡,我们通过透射电镜观察发现,单独的TMZ处理没有损伤细胞线粒体,但RSL3处理可以引起线粒体的破坏,这是铁死亡的典型效应。而RSL3与TMZ联合作用后,线粒体等细胞器则发生了显著的破坏,证实了与TMZ联用可能会增强RSL3诱导的铁死亡效应。3.RSL3和TMZ联合作用可显著抑制GBM细胞的体内生长为了观察RSL3和TMZ单独或联合使用在体内的作用,我们将GBM细胞接种到小鼠皮下造模。值得注意的是,单独应用TMZ或RSL3在小鼠体内能适度的抑制肿瘤生长,但当双药联合应用时对肿瘤生长有更强的抑制作用。免疫组化染色也显示,RSL3与TMZ联合治疗的肿瘤中Ki67阳性细胞明显减少,提示双药联合治疗时肿瘤细胞的增殖抑制更明显。RSL3或RLS3+TMZ处理组的小鼠肿瘤中GPX4蛋白的表达水平也显著降低。透射电镜数据也发现双药联合处理组的肿瘤细胞的线粒体损伤更严重。我们进一步将GBM细胞原位注射到小鼠颅内构建小鼠原位移植瘤模型,实验结果与皮下瘤实验一致,两种药物联合使用对肿瘤生长的抑制作用明显强于单独用药。因此,我们认为RSL3联合TMZ使用可能比单独用药具有更强的体内抗肿瘤效果。4.IDH1-Mu和WT的胶质母细胞瘤均对RSL3和TMZ组合敏感在临床中,胶质瘤存在较多分子突变分型,其中IDH1的突变是最常见的分子表型。已知IDH1-R132H突变（IDH1-Mu）的胶质母细胞瘤的预后优于IDH1野生型（IDH1-WT）的。为了研究RSL3对于IDH1状态的潜在影响,我们构建了IDH1-WT和IDH1-Mu的胶质母细胞瘤细胞系（LN18、LN229、GBM1）。通过检测不同药物处理不同分子分型细胞的IC50值,发现IDH1-Mu组的GBM细胞系对RSL3的杀伤更为敏感。但是联合TMZ使用时,这种差异消失了,即双药联合能对药物反应不敏感的IDH1-WT型胶质母细胞瘤细胞系也具有较强的杀伤作用。为了佐证这一观点,我们还对有/无RSL3处理的IDH1-WT和IDH1-Mu细胞分别进行了m RNA测序。测序结果分析表明,发生显著改变超过2倍的基因（Fold change＞2或＜0.5;RSL3 vs DMSO）,IDH1-Mu组要比IDH1-WT组多,且二者存在很大一部分的基因重叠,这似乎间接说明了RSL3处理后IDH1-Mu的胶质瘤比IDH1-WT的胶质瘤受影响的基因集更庞大,或者说IDH1-Mu组要比IDH1-WT组对RSL3更敏感。对测序数据进行的KEGG通路分析发现,RSL3处理后显著下调的基因富集了TGF-β信号通路,而Hippo信号通路、DNA复制和细胞周期通路仅在IDH1-Mu的胶质母细胞瘤细胞系中检测到。分析还发现无论是IDH1野生型还是突变型,均富集到了类风湿关节炎和MAPK信号通路。虽然RSL3对IDH1状态无明显影响,但TMZ对IDH1-突变型的GBM细胞的侵袭抑制作用明显强于野生型的GBM,反过来说,TMZ单药可能无法有效的抑制IDH1-WT的胶质母细胞瘤,但只要RSL3和TMZ联合使用则可以完全抵消IDH1对药物敏感性的影响,有效抑制治疗效果不佳的IDH1-WT胶质母细胞瘤的增殖。基于此,我们提出这一观点,TMZ对部分难治型IDH1-WT的GBM细胞的抑制不太明显,而添加RSL3联合可以促进TMZ对难治型GBM的抑制效果。5.FTH1和FTL与TMZ耐药密切相关我们对部分关键的铁死亡调控因子,包括GPX4、SLC7A11、FTH1、FTL、TF、TFRC、TFR2、NQO1和ATL1进行了相关性分析,通过TCGA＿GBMLGG数据库分析发现FTH1和FTL与GPX4之间存在非常大的相关性,但我们并不清楚FTH1和FTL能不能在TMZ的治疗中起到关键作用。已知MGMT基因在TMZ的耐药中起决定性作用,于是我们在TCGA＿GBMLGG数据库中分析了关键的铁调控因子与MGMT的相关性,通过聚类分析发现基因FTH1和FTL与MGMT相关性指数最高。为了验证这一结论,我们选择了MGMTHigh基因与MGMTLow基因相比上调了1.4倍以上的基因作为与MGMT相关的基因集,用GSEA数据库分析,发现FTH1和FTL的高表达可显著富集这一基因集,于是我们得到了间接证据,即FTH1和FTL的表达与MGMT相关。为了进一步得到直接证据,我们分析了来自GSE113510的LN229细胞TMZ耐药株的测序数据,将其中相对于亲本细胞株上调6倍以上的基因作为TMZ的耐药基因集进行GSEA分析,发现FTH1和FTL的高表达也能显著富集到该基因集。为了验证数据库分析的结果,通过CCK8细胞增殖实验证实了敲低/沉默FTH1或FTL基因可使GBM细胞系对TMZ敏感。因此,我们认为FTH1和FTL的表达与TMZ的敏感性相关。6.FTH1和FTL参与GBM的进展和预后的预测我们利用组织芯片对171例胶质瘤样本进行免疫组化分析,发现FTH1和FTL的表达随着胶质母细胞瘤分级I级到IV级的升高而表达增加。Kaplan-Meier生存分析也证明,FTH1或FTL低表达的患者预后明显优于高表达的患者。FTH1和FTL同时高表达的病例比其他表达组合的存活时间要短。已知GBM有四种分子亚型:间充质型、经典型、前神经型和神经型,TCGA＿GBM数据库分析发现FTH1和FTL在预后最差的间充质型GBM中的表达显著高于其他三个亚型。因此我们认为FTH1和FTL可以预测胶质瘤患者的不良预后。综上所述,我们的研究证实了RSL3对胶质母细胞瘤的生长和侵袭具有抑制作用,并为RSL3与TMZ联合使用在体外和体内均能有效覆盖IDH1分型提供了证据。此外,研究还发现,FTH1和FTL能作为预测胶质瘤患者预后不良的生物标志物,并且在TMZ的耐药中具有重要意义。