灰飞虱Laodelphax striatellus(Fall e n)属于半翅目、飞虱科,在亚洲是一种具有破坏力的农业害虫。溴氰菊酯是拟除虫菊酯类杀虫剂,目前被用于麦田灰飞虱的防治。本实验室前期工作获得了溴氰菊酯的高抗品系,并且寻找到5个组成型过表达的多功能氧化酶基因和1个酯酶基因:CYP314A1v2(2.3倍)、CYP353D1v2 5.3倍)、CYP439A1v3(4.6 倍)、CYP64Y3v2(24.0 倍)、CYP6FU1(16.0 倍)、LSCE12(11.1倍)。组成型过表达可以通过基因扩增来获得,也可以通过转录水平上的调控来达到,这包括调控区上顺式调控元件和转录因子发生改变。抗性有关的多功能氧化酶基因可以通过转录调控区上碱基突变或者插入/缺失来增强基因的表达水平。现在已报道的这类例子大多数是单个位点被鉴定出来。本文以灰飞虱溴氰菊酯抗性品系和敏感品系为实验材料,对这些组成型过表达P450基因的5’侧翼区和转录本3’ UTR区的序列进行了分析,探讨了杀虫剂选择压力下非编码区的多态性变化,利用报告基因系统和点突变技术对基因的5’侧翼区和转录本3’ UTR区进行了功能验证,分析了基因的过表达调控方式和关键突变位点。为进一步弄清灰飞虱对杀虫剂的抗性演化机制以及制定更加有效的抗性治理策略提供了理论依据。1.灰飞虱溴氰菊酯抗性相关P450基因5’侧翼区的克隆和多态性分析在先前的研究中发现灰飞虱P450基因CYP6AY3v2、CYP6FU1、YP353D1v2、CYP314v2和CYP439A1v3在溴氰菊酯抗性品系中有不同程度的过表达,以抗性品系(JH-del)和敏感品系(JHS)基因组DNA为模板,通过基因组步移技术,成功获得了这些基因的5’侧翼区序列,对应的序列长度分别为2183bp、1515bp、1771bp、1870bp和1924bp。对来自两个品系的单个个体样本进行分析,发现抗性品系的CYP6AY3v2、CYP6FU1、CYP353D1v2和CYP439A1v3基因的5’侧翼区序列多样性比敏感品系的显著低。序列相似性和系统发育关系分析显示,不同基因的5’侧翼区可以区分为不同的序列类型,而且同种酶基因的5’侧翼序列类型在抗性和敏感品系中分布具有明显差异。其中CYP6FU1在抗性品系中只有1种5’侧翼序列类型,但敏感品系则具有该基因的所有5种5’侧翼序列类型。这些结果表明这些过表达基因的调控区明显受到了选择作用。2.灰飞虱溴氰菊酯抗性相关P450基因5’侧翼区的转录调控元件分析转录水平调控是真核生物基因表达调控的最主要环节,而5’侧翼区是调控因子作用的主要功能区。本章对已克隆得到的基因侧翼区进行了分析。首先通过5’ RACE在抗性和敏感品系的混合样本中分别获得了基因CYP6AY3v2、CYP6FU1、CYP353D1v2、CYP314A1v2和CYP439A1v3的4、6、6、2 和 1 条不同的 5’ UTR 序列。其次对不同类型5’侧翼区的转录因子结合位点进行预测,发现已得到的P450基因5’侧翼区上都有多个转录起始位点和多种转录因子结合位点。第三检测不同基因的不同5’侧翼序列类型上的转录起始位点和转录因子结合位点,发现同一基因的不同5’侧翼序列类型具有不同的转录起始位点和转录因子结合位点,并由此导致了抗、感品系间的差异。这些结果为下一步对这些P450基因转录水平调控机制的研究奠定了基础。3.灰飞虱溴氰菊酯抗性相关P450基因5’侧翼区的启动子活性分析CYP6AT3v2、CYP6FU1、CYP353D1v2和CYP314A1v2的 5’ 侧翼区序列型在灰飞虱溴氰菊酯抗性和敏感品系间表现出了不同程度的分布差异,利用双荧光素酶报告基因系统对自来两个品系的5’侧翼区进行了功能验证和启动子活性比较。转染S2细胞后报告基因检测结果显示,除CYP6AY3v2的两种5’侧翼区序列均没有显示明显的活性外,其他3个酶的不同5’侧翼区序列均具有显著的启动子活性。比较同种酶不同5’侧翼区序列的启动子活性发现,CYP353D1v2不同类型侧翼区的启动子活性没有显著差异;CYP6FU1的3条5 ’侧翼区序列中,来自抗性品系的类型1比来自敏感品系的类型2的启动子活力高2.4倍,比另一个来自敏感品系的类型3高3.7倍;CYP314A1v2来自抗性品系的DNA5’-D1启动子活性比来自敏感品系的DNA5’-S3高约1.6倍,比另一个来自敏感品系的DNA5’-S5高约1.5倍。这些结果证实在抗性品系中过表达的P450基因中,CYP6FU1和CYP344 1v2具有启动子活性更强的5’侧翼区序列。这一结果提示,5’侧翼区序列上调控元件的改变可能是导致基因结构性过表达的原因之一。4.CYP6FU1基因5’侧翼区影响表达的功能突变分析已有研究报道了许多解毒酶基因调控区上单个转录因子结合位点的突变事件,基于抗药性的数量遗传性状,推测抗性相关基因可能同时受到多个遗传因子的调控,但是有关的例子却鲜有报道。CYP6FU1 5’侧翼区整个片段的活性检测显示出了抗性和敏感品系间的差异,这里我们用系列缺失和点突变技术进行了荧光素酶报告基因分析,结果显示有4个位点的突变对CYP6FU1的过表达有显著贡献。其一是-1368位的单核苷酸突变产生一个新的转录因子XBP-1结合位点,其二是-1292/-1283位点上的突变产生了新的转录因子D1结合位点,其三是-352/-342位点上的突变使原来的Dfd结合位点变成了 BR-C的结合位点,点突变实验证实,对上述3个位点进行回复突变可以显著降低5’侧翼序列片段的启动子活性。其四是-294/-194上100bp的插入片段带来了一个新的转录起始位点,5’ UTR分析证实这是一个功能转录起始位点,被检测的大多数抗性个体均从这个位点进行基因转录而获得特有的5’ UTR类型。这些结果证明,解毒代谢酶CYP6FU1的表达上调是由多个点突变导致的,揭示了害虫抗药性数量遗传的本质,有利于更好地理解抗性性状在害虫品系中的积累过程,也有助于提出更加有效的抗性治理策略。5.灰飞虱溴氰菊酯抗性相关P450基因的3’ UTR克隆和多态性分析转录本的3’ UTR能够通过影响mRNA的稳定性和翻译效率在转绿后水平上对基因的表达进行调控。这里我们以JH-del和JHS的RNA为模板,通过3’ RACE方法克隆了在灰飞虱溴氰菊酯抗性品系中过表达的P450基因的3’ UTR区,并对来自抗性和敏感品系的个体样本进行序列多态性分析。结果显示5个P450基因的3’ UTR区上有多个单核苷酸多态性位点以及插入或缺失多态性位点,根据多态性的分布,可把3’ UTR进行类型划分,其中CYP6FU1、CYP353D1v2和CYP314A1v2各有两种3’UTR类型,他们在抗性和敏感品系中的分布存在明显差异,CYP6AY3v2和CYP439A1v33’ UTR在抗、感品系间没有明显差异。这些结果显示了杀虫剂的选择压力对P450基因的3’ UTR也存在显著的作用。6.抗性相关P450基因3’ UTR区的活性分析利用两种荧光素酶报告基因系统、点突变和mRNA稳定性测定技术对CYP6FU1、CYP353D1v2和CYP314A1v2等3个基因的不同3’ UTR类型进行了活性分析。结果显示,CYP6FU1在抗性品系中的优势3’ UTR类型A与敏感品系中的优势3’ UTR类型B相比,可以提高基因表达活性1.6倍。进一步进行mRNA的稳定性分析发现,类型B让对应的mRNA稳定性显著下降。序列分析和功能位点预测发现,由于3个多态性位点的碱基突变,3’ UTR类型B上的两个miRNA(miR-306和miR-275)结合位点在类型A的序列中消失。CYP353D1v2在抗性品系中优势的D1型3’ UTR与敏感品系中优势的S1型3’ UTR相比,可以提高基因表达活性2.1倍。mRNA的稳定性分析同样发现D1让对应的mRNA稳定性增强,二级结构分析发现D1上的插入片段(+51/+73)形成了一个茎-环结构,对D1序列突变分析显示这个茎-环结构是对应的mRNA稳定性增强的原因。但分析CYP314A1v2不同3’ UTR类型间的活性没有发现显著差异。上述结果确认基因CYP6FU1和CYP353D1v2’的3’ UTR区受到了用药选择,并在基因调控上承担了一定功能,这为抗性的产生机制研究提供了新的视角。