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髓母细胞瘤（Medulloblastoma,MB）是一种位于中枢神经系统的常见儿童恶性脑肿瘤。近年来大量研究表明,MB的发生与Hedgehog（Hh）信号通路的异常激活相关。而小分子药物Vismodegib（GDC-0449,此后简称GDC）,可通过直接与Smo结合抑制Hh信号通路的异常激活达到治疗肿瘤目的,从而有望成为治疗儿童MB的潜在药物。除了参与MB的发生发展,Hh信号通路也是调控骨骼发育与稳态的重要信号通路,因而GDC对骨骼生长发育的潜在不良作用也不可忽视。现有研究已表明,在小鼠胚胎期抑制Hh信号通路导致骨和软骨发育异常。儿童期还处于骨骼生长的关键时期,而该阶段软骨发育的调控机制与胚胎期不尽相同。目前尚不完全清楚Hh信号通路抑制剂GDC是否对生长早期小鼠软骨发育产生不利影响,这方面的研究亟待加强。本文旨在探究Hh信号通路抑制剂GDC对生长早期小鼠软骨发育的影响,并初步阐明Hh信号通路在生长早期小鼠软骨发育中的作用及机制,从而为GDC科学治疗MB奠定基础。第一章:药物抑制Hh信号通路对生长早期小鼠软骨发育的影响及机制[实验方法]为了探究儿童髓母细胞瘤的潜在药物GDC对生长早期软骨发育的影响,我们选择2 W龄C57BL/6小鼠进行实验,并随机将其分为两组:对照组（Vehicle组）和实验组（GDC组）。实验组小鼠,直接给予50 mg/kg GDC,每日灌胃2次,间隔12 h,连续处理5天;与此同时,对照组小鼠,直接给予MTC原液进行灌胃,实验方法一致。待小鼠4M龄时,收取小鼠关节组织样本后进行分析:①通过Micro-CT、H＆E染色、番红固绿染色探究小鼠生长板、关节软骨及软骨下骨的形态变化;②通过Ki67免疫组织化学染色探究小鼠生长板及关节软骨细胞增殖情况;③通过TUNEL染色探究小鼠生长板及关节软骨细胞凋亡情况;④通过免疫荧光染色探究小鼠生长板及关节软骨细胞分化情况;⑤通过Micro-CT及三维分析探究小鼠软骨下骨的骨量变化。[实验结果]①Micro-CT、H＆E染色、番红固绿染色结果均显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板中间出现断裂;关节软骨周围出现骨赘;关节表面软骨明显增厚、软骨细胞数明显减少且出现大量纤维样细胞;②Ki67免疫组织化学染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板及关节软骨中增殖细胞明显减少;③TUNEL染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板和关节软骨中凋亡细胞明显增加;④免疫荧光染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板软骨细胞及关节软骨细胞出现异常分化;⑤Micro-CT 3D重构及三维分析结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠软骨下骨骨量显著下降。[结论]GDC抑制Hh信号通路引起小鼠软骨细胞增殖减少、凋亡增加以及软骨细胞分化加速,从而导致生长早期小鼠生长板和关节软骨发育缺陷。第二章:软骨细胞内敲除Smo对生长早期小鼠软骨发育的影响及机制[实验方法]1.通过LacZ染色检测Hh信号通路在小鼠生长板及关节软骨中的活性;2.通过qPCR检测Agc1-CreER在软骨细胞内对Smo的敲除效率,并通过Gli1-LacZ报告小鼠评估在软骨细胞内条件性敲除Smo对Hh信号通路活力的影响;3.以2W龄Smoflox/flox（或Smoflox/+）小鼠为对照组,2 W 龄Agc1-CreER;Smoflox/flox小鼠为实验组,腹腔注射TM,连续诱导5天,并分别于1M龄,2 M龄,4 M龄时收取小鼠关节组织样本,随后:①通过Micro-CT、H＆E染色、番红固绿染色探究小鼠生长板,关节软骨及软骨下骨的形态变化;②通过BrdU免疫荧光染色探究小鼠生长板软骨细胞及关节软骨细胞增殖情况;③通过TUNEL染色探究小鼠生长板软骨细胞及关节软骨细胞凋亡情况;④通过免疫荧光染色探究小鼠生长板软骨细胞及关节软骨细胞分化情况;⑤通过Micro-CT 3D重构及三维分析探究在软骨细胞内特异性抑制Hh信号通路后,生长早期小鼠软骨下骨的骨量变化。[实验结果]1.LacZ染色结果显示,小鼠生长板及关节软骨均具有大量LacZ阳性细胞;2.LacZ染色结果及qPCR结果均显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠软骨细胞内的LacZ信号明显减少,Smo基因表达显著下调;3.①Micro-CT、H＆E染色、番红固绿染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板变窄且生长板软骨细胞排列紊乱;骨赘产生;关节软骨增厚且表现出潮线不规则;②BrdU免疫荧光染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板软骨细胞增殖减少甚至消失,而关节软骨细胞不增殖;③TUNEL染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板软骨细胞及关节软骨细胞异常凋亡;④免疫荧光染色结果显示,与对照组小鼠相比,实验组小鼠生长板软骨细胞及关节软骨细胞结构紊乱,分化异常。⑤Micro-CT 3D重构及三维分析结果显示,与对照组小鼠相比,1 M龄及2 M龄实验组小鼠软骨下骨骨量无明显变化,而4 M龄实验组小鼠软骨下骨骨量减少。[结论]1)Hh信号通路在小鼠部分生长板及关节软骨细胞中具有高活性;2)Agc1-CreER可有效敲除软骨细胞中的Smo基因,而在小鼠软骨细胞内条件性敲除Smo可抑制细胞中Hh信号通路活力;3)Hh信号通路在生长早期小鼠生长板及关节软骨生长发育过程中起着直接调控作用。