环糊精糖基转移酶产生菌的筛选及环糊精在农业生产中的应用研究

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环糊精及其衍生物以其独特的包合性能已被广泛应用到医药、食品、化工、环境等诸多领域,但在农业生产中的应用还处于起始阶段。为解决环糊精糖基转移酶产生菌菌株筛选效率低的难题,本研究建立了一种从土壤中快速筛选环糊精糖基转移酶产生菌菌株的方法。为了进一步探索环糊精在提高农药溶解度及其药效方面的可行性,本试验以农药毒死蜱为实验对象,采用多种方法制备了环糊精β-CD及其衍生物与毒死蜱的固体包合物,对包合物进行了表征,分析了包合物对杀虫药效的影响。本文主要研究结果如下:1.建立了一种从土壤中快速筛选环糊精糖基转移酶产生菌菌株的方法。本研究从土壤中初步筛选出了149个产胞外淀粉水解酶的菌株,利用高效阴离子交换色谱检测出了微生物发酵液中的环糊精成分,从而确定了产生菌菌株;本研究检测了其中11个产生菌菌株,6株主要产CD6,5株主要产CD7。同时,在鉴定的过程中,定量检测了各种环糊精包括大环糊精(CD大于8)的含量。2.研究了环糊精与农药包合物的制备方法,确定了最佳反应条件。本研究分别利用研磨法、超声波法和饱和水溶液法制备了环糊精β-CD、Hp-β-CD和Me-β-CD与农药毒死蜱的包合物,其中饱和水溶液法包合效果最好。使用该方法环糊精β-CD、Hp-β-CD和Me-β-CD与农药毒死蜱的包合率分别为45.8%、52.0%和65.0%。采用正交试验得到β-CD包合毒死蜱的最佳反应条件:投料比为1:1(摩尔比),包合时间为3h,包合温度为60℃。3.利用紫外光谱法定量研究了β-CD及其衍生物对毒死蜱的包结行为。结果表明β-CD及其衍生物与毒死蜱均形成了包结比为1:1的包结物,形成的包合物的稳定常数分别为K=33.33mol/L(β-CD),K=343.8 mol/L(HP-β-CD),K=461.63 mol/L(Me-β-CD)。由包合物稳定常数大小可知β-CD与毒死蜱包合物的稳定性最差,而HP-β-CD、Me-β-CD都能与毒死蜱形成较稳定的包合物。利用ΔG=-RlnK计算出重要的热力学参数ΔG分别为:-8.69KJ/mol(β-CD)、-20.184KJ/mol(HP-β-CD)及-15.21KJ/mol(Me-β-CD),包合反应的吉布斯函数ΔG均为负。4.利用紫外光谱法对液体包合物进行了鉴定。当固定客体毒死蜱浓度时,随着主体β-CD、HP-β-CD、Me-β-CD浓度的增大,整个体系的吸收峰没有明显的位移,但其最大吸收峰处的吸光值逐渐增大。说明β-CD及其衍生物对毒死蜱产生了识别作用,毒死蜱进入CD的空腔,形成了包合物。5.利用红外吸收光谱和差示热分析法分别对β-CD、HP-β-CD和Me-β-CD与毒死蜱固体包合物进行了表征。差示热分析可知,三种包合物仅存在主体分子的脱水峰,毒死蜱原来的吸收峰消失;红外吸收光谱证明三种包合物中毒死蜱的特征吸收峰消失,主要表现为主体分子图谱。结果表明:β-CD、HP-β-CD和Me-β-CD与毒死蜱均形成了1:1的稳定包合物。6.包合物的室内杀虫毒力试验结果为:β-CD、HP-β-CD和Me-β-CD与毒死蜱包合物致死中浓度LC50分别16.1μg/mL、10.8μg/mL和12.3μg/mL。本研究首次利用高效阴离子交换色谱检测了产CGTase菌株发酵液中的环糊精成分,尤其是大环糊精的组成。建立了一种从土壤中快速筛选环糊精糖基转移酶产生菌菌株的新方法,利用该方法还可以检测环糊精糖基转移酶在不同阶段产生环糊精的能力大小。本研究发现通过环糊精与毒死蜱的包合作用可以增加毒死蜱在水中的溶解度,提高其药效。该研究为农药的水基化推广奠定了基础。
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