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猪伪狂犬病（Porcine Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起的猪主要疫病之一,严重影响我国养猪业的发展。猪是PRV的自然储存宿主和传染源。随着猪日龄的增长,感染PRV后的发病率和病死率逐步降低,但长期带毒排毒,导致PR长期流行。自2011年末以来,国内许多免疫Bartha-K61疫苗的猪场出现了一种比经典PRV毒力和致病力更强的新型变异毒株,为该病的净化增加了难度。本实验室在2015～2021年分离到了7株PRV毒株,其中GZQX2017株缺失g E基因,其余6株g E基因第48位和第496位各插入一个天冬氨酸（D）,符合流行变异株基因特征。g B、g C、g D被公认为是最主要的免疫保护相关蛋白,同时,g B、g C、g D基因通常被用于监测PRV进化。因此,本研究旨在基于g B、g C、g D基因分析7株贵州省PRV变异毒株的遗传演化及其与8株商品化疫苗毒株的抗原差异性,以期可以在临床上为疫苗的选用或候选疫苗毒株的筛选提供参考。1、PRV贵州变异株与疫苗株g B、g C、g D基因的克隆为了探究贵州省PRV变异株遗传演化情况及其与疫苗株抗原差异性的分子基础,应用分子克隆技术和测序技术,对本研究中尚未获得研究数据的PRV贵州变异株（GZHX2015株、GZTR2016株、GZXS2016株、GZJS2017株和GZQX2017株）和商品化疫苗株（C株和HB2000株）主要保护性抗原的编码基因g B、g C和g D进行克隆测序。结果显示:（1）g B ORF:GZQX2017株为2 742 bp、C株为2 751 bp,其余为2 745 bp;（2）g C ORF:GZQX2017株为1 440 bp、C株为1 443 bp,其余为1 464 bp;（3）g D ORF:GZQX2017株为1 215 bp、C株为1 203 bp,其余为1 209 bp。本试验共计完成了28段PRV基因片段的克隆测序,累计测序长度为27 621 bp。2、PRV贵州变异株与疫苗株g B、g C、g D基因的序列分析为详细了解贵州省PRV流行毒株主要保护性抗原的编码基因情况,通过生物信息学技术探究贵州省PRV流行毒株的演化方向及其与疫苗毒株之间的抗原差异性。采用Lasergene软件包（Seq Man软件、Edit Seq软件、Meg Align软件）、MEGA7.0软件、RDP 4.0软件和Sim Plot 3.5软件,分别对7株PRV贵州变异株和8株当前商品化疫苗株g B、g C、g D基因进行遗传演化分析,采用Lasergene软件包（Protean软件）和SVMTri P在线分析网址进行B细胞线性抗原表位预测分析。结果显示:（1）相似性分析结果表明,7株贵州变异株与国内外其他参考毒株间g B、g C、g D基因核苷酸相似性分别为97.7%～100.0%、94.7%～100.0%、98.5%～100.0%,氨基酸相似性分别为96.3%～100.0%、90.9%～100.0%、96.5%～100.0%。g B、g C、g D基因核苷酸和氨基酸相似性差异分别为1.4%、3.8%、2.0%,其中属g C基因核苷酸和氨基酸相似性最低。（2）系统进化树分析结果表明,GZQX2017株与C株、Bartha-K61株或Becker株、NIA3株位于同一大的进化枝,枝内较多小进化枝,属于PRVⅠ型;其余6株贵州株与HN1201株、He N1株、TJ株等国内流行PRV变异株位于另一大的进化枝,枝内亲缘关系较近,属于PRVⅡ型。（3）氨基酸替换分析结果表明,7株PRV贵州变异株和其他参考毒株g B、g C、g D基因氨基酸差异位点分别共计75、95和38处,占各自编码氨基酸比例分别为8.2%（75/914）、19.5%（95/487）和9.5%（38/402）,其中属g C基因氨基酸差异位点最多。（4）重组位点分析结果表明,以GZQX2017株为目的毒株,以疫苗Bartha-K61株为主要亲本时,均能检测到重组信号。（5）B细胞线性抗原表位预测分析结果:g B蛋白:GZHX2015株、GZYY2015株、GZDZ2016株、GZTR2016株、GZXS2016株、GZJS2017株、HB2000株和Fa株均共有4处抗原表位,GZQX2017株、C株和Bartha-K61株均共有3处抗原表位,Ea株共有5处抗原表位。其中GZHX2015株、GZYY2015株、GZDZ2016株、GZXS2016株、GZJS2017株和HB2000株均有1处位于759～778 aa的抗原表位（IANFFQSLGDVGAAVGKVVL）与其他参与分析的毒株均不同;GZTR2016株有1处抗原表位（GSAEFARLRFTYDHIQAHVN）,位于527～546 aa,与其他参与分析的毒株均不同;Ea株有1处位于716～735 aa的抗原表位（EELADTGLLDYSEIQRRNQP）与其他参与分析的毒株均不同;Ea株与Fa株均有1处位于555～574 aa的抗原表位（AWCELHNKDRTLWGEMSRLN）与其他参与分析的毒株均不同;C株和Bartha-K61株抗原表位一致,与GZQX2017株相比,所有位点均后移了3 aa。g C蛋白:HB2000株、Ea株和HB-98株均共有3处抗原表位,且位点与氨基酸顺序均完全一致,但均与7株贵州变异株不同;Fa株与SA215株均共有2处抗原表位,且位点与氨基酸顺序均完全一致,其中位于189～208 aa的抗原表位（VVVEGERATVANVSGKVSVR）与GZHX2015株、GZYY2015株、GZDZ2016株、GZTR2016株、GZXS2016株和GZJS2017株一致,位于126～145 aa的抗原表位（GCAVVPRAGETFEVRFYRRG）系其独有;7株贵州变异株与C株、Bartha-K61株均只有1处抗原表位,其中C株与Bartha-K61株（Gene Bank登录序列）的抗原表位一致,位于7～26 aa（AMLALLAPYAAAIAAAPSTT）,GZQX2017株与Bartha-K61株（本研究测序序列）的抗原表位一致,位于63～82 aa（AVSTPPVPPPSVSRRKPPRN）。g D蛋白:GZHX2015株、GZYY2015株、GZDZ2016株、GZTR2016株、GZXS2016株、GZJS2017株、GZQX2017株、C株、Bartha-K61株、HB2000株、Ea株和Fa株均共有2处抗原表位,表位的氨基酸顺序均一致,但有位点前移或后移的差异;SA215株共有3处抗原表位,其中有2处抗原表位位于93～112 aa（RDHVAWYRIADGCAHLLYFI）和66～85 aa（CGVVALISDLQVDRLLNEAV）与其他参与分析毒株均不同。上述研究结果表明,PRV GZQX2017株可能是以Bartha-K61株为主要亲本进行重组产生的g E基因自然缺失株,后续有望将其作为候选疫苗毒株进一步研究。Bartha-K61疫苗对PRV变异株仅提供部分保护可能与两者B细胞抗原表位间差异有关。结合文献研究报道,建议临床上应尽量选用与流行毒株抗原表位无显著差异的疫苗,或选用高病毒滴度的疫苗进行免疫。