论文部分内容阅读
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)是戊糖磷酸途径(Pentose PhosphatePathway)氧化阶段的第三个酶。戊糖磷酸途径的生物学意义土要有两个方而:
1.是细胞产生还原力NADPH的主要途径,NADPH在还原性生物合成中起负氢离子供体的作用。提供的还原力主要用于保护细胞免受氧化胁迫的危害,合成脂肪酸固醇类物质,以及保证脊椎动物的红细胞中谷胱甘肽处于还原态。2.足细胞内不同结构糖分子的重要来源,并为各种单糖的互相转变提供条件。最近,磷酸戊糖途径又被发现在肿瘤增殖过程扮演着重要的角色,人们对这个经典途径又有了新的认识和兴趣。6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化的反应是将6-磷酸葡萄糖酸脱羧氧化成5-磷酸核酮糖,产生二氧化碳并将NADP还原成NADPH。我们研究的是酿酒酵母中的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶Gnd1。Gnd1的晶体用X射线衍射方法的到的数据分辨率达2.37A。Gnd1是二聚分子,每个单体结构可分成三个结构域。1到127号残基构成典型的"Rossman Fold",128号到175号残基构成一个α/β单位,与Rossrnan Fold共同组成了NADP的结合区。另外两个结构域完全南α螺旋组成,这两个结构域在功能上是一致的--二聚体的聚合及与底物6-磷酸葡萄糖酸的结合。这两个结构域在结构上被一个长loop分开,176到433号残基包括了大部分参加聚合的残基,并形成了催化口袋。第三个区域结构很特殊,只含有一个α螺旋,连接这个α螺旋与第二个结构域中的α螺旋的长loop从Gnd1的二聚体的另一个分子中穿过。最后这个α螺旋在进化上高度保守,它像一个盖子一样覆盖在另一个分子的催化口袋上,它包含的Arg446和His452残基负责与底物相互作用。从我们解出的Gnd1结构中发现每个蛋白亚基各有两个柠檬酸分子结合在活性位点上,而柠檬酸分子是Gnd1的抑制剂,这为设计6PGDH的小分子抑制类药物提供了线索。
还研究了Gnd1的酶促动力学,通过测量在28℃,pH 7.5条件下,340nm处NADPH吸收的增加,得出6PGDH催化的反应是有序机制,6-磷酸葡萄糖酸的Km值是50.26±9.42μM, NADP的Km值是35.27±5.84μM。为研究Gnd1蛋白C端的作用,我们还分别表达纯化了去C端35,39和53个残基的蛋白,虽然这些突变蛋白仍然维持二聚,但状态并不稳定,而且失去了生物学活性,因此我们推测C端对维持蛋白质稳定性和酶活有重要作用。