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目的:石榴花是新疆地产优势药材,本研究观察石榴花提取物--石榴花多酚的调脂功效及可能机制,同时测定石榴花多酚中鞣花酸和没食子酸的含量,观察这两种活性物质在非酒精性脂肪肝病防治中的作用。方法:1.采用高脂饲料喂养载脂蛋白E缺失小鼠8周,建立非酒精性脂肪肝病动物模型;2.MTT法筛选油酸浓度,以0.2mM的油酸孵育chang liver细胞24h,检测细胞内TG水平,油红O染色观察细胞内脂质蓄积,建立非酒精性脂肪肝病细胞模型。3.采用140mg·kg-1的石榴花多酚灌胃模型小鼠8周后,取血分离血清全自动生化仪检测血糖、血脂水平和AST、ALT水平;ELISA法检测血清胰岛素水平,计算胰岛素抵抗指数;取肝脏匀浆全自动生化仪检测肝脂水平,试剂盒检测ROS、MDA、SOD、GSH-PX水平;HE染色观察肝脏病理改变;免疫组化法观察各组小鼠AMPK、SirT3、ACC2、CPT-1A蛋白表达水平。4.筛选石榴花多酚浓度后干预模型细胞24h,油红O染色观察细胞内脂质蓄积,收集细胞进行蛋白定量,试剂盒检测各组细胞TG水平、SOD、MDA、GSH-PX活力;ELISA法检测细胞TNF-α和IL-8水平;流式细胞仪检测细胞ROS活力;RT-PCR法检测SirT3、AMPK、ACC2和CPT-1A的mRNA表达,Western-blot法检测细胞SirT3、AMPK、P-AMPK、P-ACC2、ACC2和CPT-1A的蛋白表达。5.高效液相色谱法测定石榴花多酚中鞣花酸和没食子的含量。6.筛选没食子酸、鞣花酸给药浓度后分别干预模型细胞24h,油红O染色观察细胞内脂质蓄积,收集细胞进行蛋白定量,试剂盒检测各组细胞TG水平、SOD、MDA、GSH-PX活力;ELISA法检测细胞TNF-α和IL-8水平;流式细胞仪检测细胞ROS活力;RT-PCR法检测SirT3、AMPK、ACC2和CPT-1A的mRNA表达,Western-blo法检测细胞SirT3、AMPK、P-AMPK、P-ACC2、ACC2和CPT-1A的蛋白表达。结果:1.高脂饲料喂养载脂蛋白E缺失小鼠能显著增加其血脂水平和肝脂水平,动物出现胰岛素抵抗,TNF-α和IL-8等炎性细胞因子水平明显升高,符合人类非酒精性脂肪肝病发病特征,动物模型成功复制。2.MTT结果显示采用0.2~1mM的油酸孵育细胞24h对细胞的正常生长无影响,该浓度范围的油酸孵育细胞24h后,与空白组比较,TG水平显著上升(P<0.01),油红O染色显示细胞内脂质沉积较空白组增加,提示细胞模型建立成功。3.用石榴花多酚干预8周后,与模型组相比,血清TC和TG水平显著下降(P<0.01),AST、ALT水平显著下降(P<0.01),血清胰岛素水平显著下降(P<0.05);肝脏TC、TG水平显著下降(P<0.05,P<0.01),肝匀浆SOD和GSH-PX水平显著上升(P<0.01),MDA水平显著下降(P<0.01)。病理HE染色结果显示石榴花多酚组缓解肝细胞水肿,肝脏细胞胞浆内脂滴较模型组减少,炎细胞浸润减少。免疫组化结果提示石榴花多酚增加SirT3、AMPK和CPT-1A表达,减少ACC2表达。4.MTT法筛选出不影响细胞生长的石榴花多酚干预模型细胞24h后,细胞内TG较模型组显著降低(P<0.05,P<0.01),油红O染色可见与模型组比较细胞内脂滴明显减少;与模型组相比,细胞MDA显著下降(P<0.05,P<0.01),SOD、GSH-PX水平显著上升(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,ROS水平显著下降(P<0.01);TNF-α和IL-8水平显著下降(P<0.01);SirT3和CPT-1A的mRNA表达水平较模型组显著上升(P<0.05,P<0.01),ACC2mRNA表达水平较模型组显著下降(P<0.01),SirT3和CPT-1A的蛋白表达水平较模型组显著上升(P<0.01),AMPK和ACC2磷酸化程度与模型组比较显著增加(P<0.01)。5.高效液相色谱测试显示石榴花多酚中没食子酸含量为1.91mg·g-1,鞣花酸含量为12.09mg·g-1。浓度筛选后用不影响细胞生长的没食子酸和鞣花酸浓度干预模型细胞,结果显示,与模型组相比,没食子酸组和鞣花酸组显著降低细胞内TG水平(P<0.05,P<0.01);油红O染色结果显示,没食子酸和鞣花酸能减少NAFLD细胞模型内脂质蓄积,与模型组比较,没食子酸组和鞣花酸组细胞显著降低MDA水平(P<0.05,P<0.01),升高细胞SOD、GSH-PX活力(P<0.05,P<0.01);鞣花酸组显著降低细胞ROS水平(P<0.01);与模型组比较,没食子酸组和鞣花酸组细胞显著降低TNF-α和IL-8水平(P<0.01);SirT3和CPT-1A、AMPK的mRNA表达水平较模型组显著上升(P<0.05,P<0.01),ACC2mRNA表达水平较模型组显著下降(P<0.01),SirT3和CPT-1A的蛋白表达水平较模型组显著上升(P<0.01),AMPK和ACC2磷酸化程度与模型组比较显著增加(P<0.01)。结论:1.非酒精性脂肪肝病整体动物和细胞模型的复制和建立在本研究中我们建立了非酒精性脂肪肝病的动物模型和细胞模型,用高脂饲料喂养载脂蛋白E缺失小鼠,用油酸孵育人张氏肝细胞,结果显示模型动物和细胞均表现出和人类非酒精性脂肪肝病发病相符的特征,如血脂水平升高,肝脏病理改变,胰岛素抵抗产生,抗氧化和氧化应激系统失衡等,以此推断模型成立。2.石榴花多酚有良好的调脂和肝脏保护作用。石榴花多酚有效降低模型动物血脂水平和肝脂水平,在模型细胞上能有效减少TG在细胞内的蓄积,表现出良好的调脂功效,同时减少模型动物血清AST、ALT水平,提示可能在非酒精性脂肪肝病动物上具有肝脏保护作用。3.石榴花多酚调脂作用的机制可能是如下几点:(1)石榴花多酚有效缓解胰岛素抵抗。(2)石榴花多酚具有良好的抗氧化作用。(3)石榴花多酚可显著减少TNF-α和IL-8等炎性细胞因子的生成,可能减缓非酒精脂肪肝病的发展。(4)石榴花多酚可能通过提高SirT3水平,增加AMPK的磷酸化水平,使AMPK活化后增加脂肪酸合成的限速酶ACC2的磷酸化水平,使ACC2失活,解除ACC2对脂肪酸氧化过程中的限速酶CPT-1A的抑制作用,脂肪酸氧化加强,脂肪酸合成下降,缓解了肝细胞中TG的蓄积。4.石榴花多酚调脂功效可能与其含有鞣花酸、没食子酸相关。高效液相色谱法测定发现石榴花多酚中没食子酸含量为1.91mg·g-1,鞣花酸含量为12.09mg·g-1。在细胞实验中观察发现没食子酸和鞣花酸调脂作用和对炎性细胞因子、脂质代谢相关酶基因蛋白表达的影响与石榴花多酚十分相似,推测石榴花多酚调脂功效可能与其含有这两种活性物质相关。