论文部分内容阅读
目的:抑郁症是一种常见的心理性疾病。抑郁症给患者本人带来了无限的痛苦,使患者对生活失去了乐趣,并伴有严重的躯体症状。然而,抑郁症发病的分子机制尚待阐明。有丝分裂阻滞缺陷蛋白（mitotic arrest deficient protein,MAD2B）,是一种高度保守的蛋白,也称hRev7或MAD2L2。既往的研究表明,MAD2B在神经系统中广泛表达,且主要在神经元中表达。MAD2B抑制有丝分裂过程后期促进复合体（anaphase promoting complex,APC）的活性,而Cdh1/APC复合物在调控神经元发育、突触可塑性以及学习记忆等生理过程中发挥重要作用。然而,MAD2B在抑郁症中的作用及其机制尚未可知。因此,本研究首先探究抑郁模型小鼠海马区是否有MAD2B表达变化,再拟采用腺相关病毒微量注射方法在海马组织中干预MAD2B表达以及在原代培养的海马神经元转染慢病毒干预MAD2B表达,探究其对小鼠抑郁样行为的影响和分子机制。研究方法:1.使用7-8周雄性C57BL/6J小鼠,采用两种方式进行慢性抑郁造模,包括连续3周腹腔注射皮质酮（corticosterone,CORT）与连续5周的慢性不可预期应激（chronic unpredictable stress,CUS）。通过蔗糖偏好实验、强迫游泳以及悬尾实验等检测小鼠的抑郁样行为;疲劳转棒实验检测各组小鼠的运动能力。通过以上行为学判断这两种慢性抑郁造模方式是否成功;2.用Western Blot方法检测对照组和慢性抑郁造模小鼠海马组织中MAD2B的表达量;3.将准备CUS造模的C57BL/6J小鼠随机地分成以下4组:Ctrl+AAV8-eGFP、Ctrl+AAV8-MAD2B-OE-eGFP、CUS+AAV8-eGFP、CUS+AAV8-MAD2B-OE-eGFP。同样的,将准备CORT造模的C57BL/6J小鼠随机地分成以下4组:Ctrl+AAV8-eGFP、Ctrl+AAV8-MAD2B-OE-eGFP、CORT+AAV8-eGFP、CORT+AAV8-MAD2B-OE-eGFP。通过脑立体定位注射分别将MAD2B过表达腺相关病毒8型（adeno-associated virus,AAV8）与对照病毒注射到小鼠的海马组织中。病毒表达3周后,将小鼠分别进行3周的皮质酮注射造模或5周的CUS慢性造模。在造模前后,为了检测小鼠是否出现类似于“快感缺失”与“绝望情绪”的抑郁行为,对小鼠进行蔗糖偏好实验、强迫游泳与悬尾实验进行检测。并用疲劳转棒实验检测各组小鼠的运动能力。以上结果可以用来评估小鼠海马组织中过表达MAD2B对小鼠抑郁样行为的影响;4.原代培养海马神经元,给予CORT（100μM）处理24 h,采用Western Blot及Q-RT-PCR等方法检测糖皮质激素受体（glucocorticoid recepter,GR）、代谢性谷氨酸受体4（metabolic glutamate receptor 4,GRM4）、miR-29b-3p等的表达,同时过表达MAD2B,以阐述MAD2B的作用机制。研究结果:1.经过连续3周的皮质酮腹腔注射与连续五周的CUS慢性抑郁造模,用蔗糖偏好实验、强迫游泳与悬尾实验进行检测,结果发现,抑郁造模后的小鼠出现了抑郁样行为,与对照组相比,模型组小鼠表现为在蔗糖偏好实验中对糖水偏好程度减低、强迫游泳和悬尾实验中不动时间延长。这提示小鼠经过两种不同的慢性抑郁造模后均出现了抑郁样行为,说明这两种慢性抑郁造模方式成功。2.通过Western Blot检测了小鼠海马组织中MAD2B的表达变化,结果发现,与对照组相比,在抑郁造模后的小鼠海马组织中MAD2B表达下调。3.在小鼠海马组织中分别注射对照与过表达MAD2B腺相关病毒,3周后,进行了蔗糖偏好、强迫游泳和悬尾实验检测小鼠的抑郁样行为。结果表明,各组小鼠在蔗糖偏好实验中对糖水的偏好程度,在强迫游泳与悬尾实验中不动时间没有差异,这提示在正常状态下,MAD2B并不影响小鼠抑郁行为。然而,注射病毒3周再进行慢性抑郁造模,并检测以上行为,结果表明,造模小鼠出现了抑郁样行为,但在海马组织中过表达MAD2B后可以逆转CUS和CORT诱导的小鼠抑郁样行为,表现为在蔗糖偏好实验中对糖水的偏好程度增加,在强迫游泳和悬尾实验中不动时间缩短。这表明,在小鼠海马组织中过表达MAD2B可以逆转小鼠慢性抑郁造模所导致的抑郁样行为。4.在经过慢性抑郁造模后的小鼠海马组织中过表达MAD2B,GR表达无明显改变,提示GR不是MAD2B发挥抗抑郁作用中的关键分子。5.经过慢性抑郁造模后,小鼠海马组织中GRM4表达上调。在海马组织中过表达MAD2B,可以使海马组织中GRM4的表达下调。这些结果表明,MAD2B通过下调GRM4发挥抗抑郁的作用。6.在原代培养的海马神经元中,与对照组相比,给予CORT药物处理后MAD2B的表达量明显下调,GRM4表达上调;在海马神经元转染MAD2B过表达慢病毒后,miR-29b-3p表达上调,GRM4表达下调。并且在海马神经元中过表达MAD2B可以逆转CORT诱导的miR-29b-3p与GRM4的表达变化。以上结果表明,MAD2B通过上调miR-29b-3p,进而下调GRM4的表达而发挥抗抑郁的作用。结论:我们通过动物建模、行为学检测、脑立体定位注射、病毒转染、分子生物学实验等技术方法发现:MAD2B通过调控miR-29b-3p/GRM4发挥其抗抑郁作用。