论文部分内容阅读
已经知道谷类糊粉层细胞可以作为一个独立的系统研究各种外加信号。由于其对GA和ABA响应的差异,糊粉层细胞已经成为研究植物激素调控细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)以及相关基因表达的一个模式系统。血红素加氧酶(heme oxygenase, HO, EC1.14.99.3)催化血红素(hemin)产生一氧化碳(carbon monoxide, CO).最近的研究发现HO/CO和一氧化氮(nitric oxide, NO)作用相类似,具有调控植物生长发育和抗逆的特性。在动物中的研究还发现氢气(hydrogen, H2)可以作为一种潜在的抗氧化物质,可以减轻活性氧(reactive oxygen species, ROS)造成的氧化伤害,但在植物中的生理作用不明。因此,本论文探讨了HO/CO和H2调控小麦糊粉层细胞α-淀粉酶基因表达以及PCD的分子机理。主要研究结果如下：1.以小麦糊粉层细胞的α-Amy2/54基因为分子探针研究一氧化氮(NO)／环鸟苷酸(cGMP)和血红素加氧酶-1(HO-1)的相互作用。研究发现释放NO的化合物sodium nitroprusside (SNP)和spermine NONOate (NONOate)均能以GA依赖的方式上调a-Amy2/54基因表达和α-淀粉酶的活性。HO-1的诱导剂氯化血红素(hemin)以及HO代谢产物CO也具有和NO相类似的作用。SNP对a-Amy2/54基因表达和酶活性的诱导作用能被cGMP的类似物8-Br-cGMP (8-Br)模拟；上述SNP/8-Br的作用被HO-1的专一性抑制剂ZnPPIX部分阻断,CO则可以逆转ZnPPIX作用。SNP和8-Br能上调HO-1的基因表达和酶活性,其中SNP的诱导作用则能被NO清除剂cPTIO和鸟苷酸环化酶的抑制剂LY83583抑制。分子生物学的证据表明GA和SNP、8-Br或cO共处理能上调GA诱导的GAMYB的基因表达和下调ABA引发的PKABA1的基因表达；GA和cPTIO、LY83583或ZnPPIX共处理则具有相反的效果。上述结果暗示在GA处理的小麦糊粉层中,HO-1可能参与NO/cGMP对a-Amy2/54基因表达的诱导作用。2.已经知道,HO-1在动植物中具有抵御各种胁迫和氧化伤害的作用。以小麦糊粉层细胞为实验材料,我们首先证明GA促进糊粉层细胞PCD,而ABA则具有抑制效应。GA处理后期的小麦糊粉层细胞HO活性和HO-1蛋白表达量均低于ABA处理。HO-1抑制剂ZnPPIX的预处理不仅能够降低HO的活性,同时也能加速GA诱导的小麦糊粉层细胞PCD。HO-1诱导物hematin以及HO产物CO水溶液和GA组合处理,不仅能上调HO的表达,还能延迟GA诱导的PCD；但是上述效应能够被ZnPPIX所逆转,说明HO上调表达能够延迟小麦糊粉层细胞的PCD。过氧化氢(H202)的含量和HO活性以及基因表达则呈现相反的效应,药理学实验证明清除或者提高H202含量可以延迟或者加速小麦糊粉层细胞的PCD. CO和BR能够上调CAT和APX的酶活性和基因表达,这可能与H202的含量降低相关。三种已知的抗氧化剂BHT、DTT和AsC能够延迟PCD,并且能够模拟hematin和CO的作用,包括上调HO的表达。总之,HO的上调表达延迟PCD的发生可能与H202的含量下降有关。3.在小麦的糊粉层细胞中,我们的研究发现动物中HO的诱导物CoCl2和CoPPIX预处理能够延缓GA诱导的PCD; ZnPPIX预处理不仅能够降低HO的活性,还能够加速糊粉层细胞的PCD. HO的代谢产物BR和CO的水溶液预处理则具有与CoCl2和CoPPIX相类似的效果,CO预处理也能上调HO的活性。CoCl2、CoPPIX、CO和BR预处理,都能下调GA诱导的NADPH氧化酶的基因表达和超氧阴离子(O2·-)的含量,上调SOD、CAT和APX的基因表达和酶活性,同时降低O2·-产生速率和H202的含量。因此我们提出：CoCl2和CoPPIX预处理诱导的HO的上调表达以及延迟的小麦糊粉层细胞的PCD可能与ROS含量下降有关。4.小麦糊粉层细胞中内源H2的含量随着GA处理的时间延长程呈现不断下降的趋势；应用外源H2水溶液和GA共处理则能延缓小麦糊粉层细胞的PCD。H2处理降低ABA和GA处理的糊粉层细胞原生质体中ROS的含量,以及小麦糊粉层细胞中超氧阴离子(O2·-)、H2O2和TBARS的含量。上述作用可能与H2能提高APX、CAT和SOD的基因表达和酶活性以及降低NADPH氧化酶的基因表达有关。研究还发现,H2对ROS中氧化性最强的羟自由基(·OH)具有直接的清除作用,从而提高糊粉层细胞的存活率。另外H2对亚硝酸阴离子(ONOO-)诱导的小麦糊粉层细胞PCD也具有明显的延缓作用。总之,我们推测H2延缓糊粉层细胞PCD的发生可能与其作为一种有效的抗氧化剂,通过迅速的扩散并通过细胞膜,从而直接清除·OH或通过调控抗氧化系统降低02‘-和H202的含量有关。