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宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一,全世界每年有25万妇女死于宫颈癌,约50万宫颈癌新发病例,目前已明确HPV感染特别是高危型HPV持续感染与宫颈癌发病的密切关系。在所有HPV感染妇女人群中,最终约有10%发展为HPV持续感染状态。临床上仍缺乏有效的清除HPV感染的手段,目前没有针对HPV的治疗药物,临床上常用的干扰素、HPV预防性疫苗疗效亦有限,针对大量HPV持续感染状态人群,亟待有效的防范或干预措施。光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)具有创伤小、选择性强、重复性好、毒性小等优点,目前已广泛应用于多种恶性肿瘤的治疗,但在妇产科疾病特别是宫颈疾病方面仍处于起步阶段。本实验选用的光敏剂5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic, ALA)是第二代光敏剂,能选择性地积聚在病毒感染增殖活跃的细胞中,克服第一代光敏剂在体内滞留时间长、所需避光时间长、组织选择性差等缺陷。本实验以宫颈鳞癌细胞Caski细胞和宫颈腺癌细胞Hela细胞为研究对象,通过SRB法、流式细胞仪、荧光实时定量PCR、蛋白免疫印迹法,探讨新型光敏剂5-氨基酮戊酸介导的光动力治疗(ALA-PDT)清除HPV感染的机制和诱导其凋亡的分子机理,为ALA-PDT最终走向临床提供实验依据和理论支持。目的1.观察ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela.. Caski细胞生长的影响,并筛选出ALA-PDT对宫颈癌细胞生长影响的最佳作用参数(光敏剂浓度+激光剂量)。2.观察ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞HPV18/16E6、E7基因mRNA的影响,明确其清除HPV感染的能力。3.测定ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞凋亡相关基因表达的影响,探寻ALA-PDT诱导凋亡的通路。方法1.SRB法检测ALA-PDT作用于宫颈癌细胞Hel、Caski细胞后细胞生长的变化,并比较两种细胞对ALA-PDT的敏感性差异。2. Annexin V/PI染色-流式细胞仪检测ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞凋亡的影响。3. Real-time PCR检测ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞内Caspase-3、P53、HPV18/16E6/E7mRNA表达水平的影响。4. Western Blot检测ALA-PDT对宫颈癌细胞Hela、Caski细胞内P53、cleaved Caspase-3蛋白的表达影响。结果1.SRB检测ALA-PDT对Hela和Caksi细胞增殖作用的影响：单纯的光敏剂ALA组或者单纯的光动力PDT组作用于细胞,与对照组相比,细胞的生存率差异无统计学意义(P>0.05)。同一激光剂量、不同光敏剂浓度下,细胞的生存率有显著差异(P<0.05)。对Hela细胞当光敏剂浓度在0.05-0.15mM之间,对Caski细胞当光敏剂浓度在0.05-0.20mM之间时,细胞的生长抑制率随着ALA浓度增加而显著提高(P<0.05)。同一光敏剂浓度、不同激光剂量,细胞的生存率均有显著差异(P<0.05)。随着光敏剂ALA浓度的增加、激光剂量的增大,ALA-PDT对细胞生存率影响逐渐增强,但当ALA浓度以及激光剂量增加到一定剂量时,对细胞的生存率影响达到饱和、不再增强。此外,Hela细胞对ALA-PDT作用比Caski细胞更敏感。2. Annexin V/PI染色-流式细胞仪检测细胞凋亡：不同光敏剂浓度的ALA-PDT组的凋亡率与对照组相比有显著差异(P<0.05)。当光敏剂浓度剂量较低时,以早期凋亡为主；当光敏剂浓度加大到1mM时,以晚期凋亡为主,总凋亡率显著升高。3. Real-time PCR检测结果：与各自对照组相比,Hela细胞ALA-PDT组各目的基因的相对表达量,HPV18E6、HPV18E7表达均显著下调,而Caspase-3、P53表达均显著上调；Caski细胞ALA-PDT组各目的基因的相对表达量,HPV16E6、HPV16E7表达均显著下调,Caspase-3、P53表达均显著上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。4. Western Blot检测结果：与对照组相比,Hela细胞和Caski细胞的ALA-PDT组细胞内P53和cleaved Caspase-3蛋白的表达均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1. ALA-PDT对宫颈癌Hela和Caski细胞有抑制增殖的作用,在一定范围内对细胞的杀伤作用呈现剂量-效应关系,存在浓度饱和以及激光剂量饱和的现象,不同的细胞对ALA-PDT的敏感性不同。2.ALA-PDT诱导细胞凋亡,并且随着ALA浓度的增加,凋亡率呈上升趋势。3.在基因水平说明ALA-PDT可以清除HPV感染。4.P53和Caspase-3可能为ALA-PDT致宫颈癌细胞凋亡通路效应基因。