恶性肿瘤的生长、侵袭和转移需要充分的血液供应。新生血管生成(neovascularization)主要包括血管发生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)两种方式,它们均依赖于内皮细胞。前者指中胚层来源的血管母细胞(hemangioblast)原位分化成内皮细胞,并生长形成循环血管;后者则指在已有的血管网基础上,内皮细胞通过分裂、芽生、扩展、延伸等机制形成新的血管网。血管发生和血管新生都参与了肿瘤新生血管生成过程,因而针对内皮细胞的抗血管治疗成为临床治疗许多恶性肿瘤的一个重要策略,并取得了良好效果。然而总是存在一些耐药病例,表明恶性肿瘤中可能存在不依赖内皮细胞的血管生成方式。　　 1999年,美国Iowas大学Maniotis等根据对人眼葡萄膜黑色素瘤微循环的研究,发现了一种与经典的肿瘤血管生成途径完全不同、不依赖内皮细胞的全新肿瘤血管模式,称之为“血管生成拟态(ivasculogenic mimicry,VM)”。肿瘤生长过程中,某些恶性细胞可表达多潜能未分化的胚胎样细胞表型,通过模拟内皮细胞并与细胞外基质相互作用形成运输血液的管道系统,从而与宿主血管相连使肿瘤获得血液供应,这种模拟胚胎期血管形成的过程称为“血管生成拟态”。VM有以下特征:(1)血管壁主要由肿瘤细胞而非内皮细胞构成,有一层基底膜样物;(2)内皮特异标记的免疫组化染色(FⅧRag、CD31、CD34、KDR等)呈阴性反应,有PAS染色阳性物质;(3)红细胞漏出和微血栓形成的情况少见,血管周围很少见到肿瘤中心性坏死现象;(4)仅存在于高侵袭性肿瘤,而非低侵袭性肿瘤或良性肿瘤。　　 血管生成拟态现象对肿瘤生物学行为具有十分重要的意义。一方面,经血管生成拟态方式形成的血管没有内皮细胞的屏障作用,从理论上讲可以为肿瘤的生长提供良好的灌注;另一方面,血管生成拟态的发生需要破坏组织形成管道,加之缺乏内皮细胞的屏障作用,管壁外衬的肿瘤细胞在释放蛋白水解酶并溶解基底膜后有直接进入血流的可能,因此更有利于肿瘤的侵袭和转移。VM是对传统血管生成理论的重要补充,不仅解释了血管生成理论难以说明的一些问题,而且为-抑制肿瘤血液供应提供了新的思路和方法。随后的研究发现,血管生成拟态不仅存在于眼葡萄膜黑色素瘤中,而且同样存在于皮肤黑色素瘤、卵巢癌、炎性乳癌、胃癌、肝癌、前列腺癌等恶性肿瘤中;VM不仅与肿瘤的生长、侵袭转移等生物学行为有关,而且和疾病的治疗预后密切相关。　　 星形细胞瘤(astrocytoma)是成人脑组织最常见的原发恶性肿瘤,是人体血管化程度最高的肿瘤之一,有明显的血管增殖和生成特性,微血管增殖是星形细胞瘤分级的重要标准。胶质母细胞瘤(glioblastoma)是星形细胞瘤的最高级别(WHOⅣ),是已知血管化程度最高的非血管源性恶性肿瘤。针对内皮细胞的抗血管药物治疗已经在约50％的星形细胞瘤患者取得效果,但是临床耐药病例却逐渐增多。为了更有效的进行临床治疗,深入研究星形细胞瘤血管生成的分子机制是十分必要的。以往研究已经证实,血管发生和血管新生都参与了星形细胞瘤血管生成,但血管生成拟态是否参与了星形细胞瘤的血管生成,其与星形细胞瘤的治疗预后的关系如何,迄今为止还没有系统的研究。　　 1997年Folkman教授在血管内皮瘤细胞系的条件培养基中发现了一种抗血管新生内源性糖蛋白,称之为内皮抑素(endostatin)。内皮抑素具有强烈的抗血管新生和抗肿瘤作用,很快被应用于临床治疗恶性治肿瘤。然而由于生产提纯非常困难,内皮抑素的临床应用受到限制。恩度(Endostar)是一种重组人内皮抑素,由中华人民共和国食品药品监督局2005年批准用于临床治疗非小细胞肺癌,我国学者在血管内皮抑素的结构上增加了9个氨基酸,成功解决了重组人内皮抑素稳定性差的问题。临床应用及相关研究已经证实恩度具有很强的抗血管新生和抗肿瘤作用,但恩度是否对血管生成拟态有抑制作用未见报道。　　 目的：　　 本实验中我们首先用人组织切片双重染色观察星形细胞瘤是否存在血管生成拟态现象并分析其临床意义;其次,我们在Matrigel上三维培养星形细胞瘤细胞系U251、SHG44,体外观察星形细胞瘤细胞形成VM的能力;最后,研究恩度在体外对星形细胞瘤细胞的增殖、侵袭及VM的抑制作用,并利用Real time RT-PCR和Western blot技术探讨相关的分子机制。　　 实验方法：　　 一、临床病理标本收集　　 收集中国医科大学附属盛京医院病理科1998-2006年诊断的星形细胞瘤病例,选择临床资料完整的石蜡标本共80例。其中弥漫型星形细胞瘤(WHOⅡ)30例,间变型星形细胞瘤(WHOⅢ)20例,胶质母细胞瘤(WHOⅣ)30例。　　 二、免疫组化和PAS双重染色　　 为了更直观的观察VM结构,本实验设计了CD34与PAS、GFAP与PAS两种双重染色方案。首先按照间接法进行CD34或GFAP免疫组化染色,当DAB显色后,进行PAS染色,再苏木素复染,封片。　　 三、组织切片形态观察及VM的确定　　 光学显微镜下观察双重染色的组织切片。PAS阳性CD34阴性内有红细胞的管腔认定为VM血管,每张石蜡切片5个随机视野(100x)有超过30％的VM血管定义为该患者存在血管生成拟态现象。　　 四、细胞培养　　 共4种细胞,星形细胞瘤细胞系U251、SHG44传代培养,人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)、大鼠脑星形胶质细胞(astrocyte)原代培养。细胞培养于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中,在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养,细胞贴壁生长。　　 五、细胞三维培养　　 Matrigel胶4℃过夜解冻,冰上操作,吸取Matrigel胶至96孔培养板,50μl/孔,注意勿产生气泡,置37℃培养箱中孵育1h,使其凝固。对数生长期的上述4种细胞,取细胞悬液100μl加入已铺胶的96孔细胞培养板,细胞数为1×104个/孔,培养24h、48h,在倒置相差显微镜下(100x)对细胞小管形成情况进行图像观察及采集。　　 六、MTT测定细胞增殖情况　　 对数生长期的星形细胞瘤细胞系U251、SHG44,取细胞悬液100μl加入96孔细胞培养板,每孔约含1×104个细胞,分别用不同浓度的恩度(0,125,250,500,and1000μg/ml)作用12h、24h、36h,MTT法测定细胞的增殖情况。　　 七、Transwell测定细胞侵袭能力　　 将用Matrigel包被好的Transwell小室放入24孔板中,下室加入含20％FBS的高糖DMEM培养液250μl,加入已稀释的浓度为2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml的恩度工作液250μl,使下室培养体系恩度终浓度分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml:取细胞悬液50μl加入上室,细胞数为1×105个/孔,在上室加入恩度至终浓度为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,浓度与下室药物浓度相对应,培养24h。用棉签擦去微孔膜上层的Matrigel胶及细胞;甲醇室温下固定15min,苏木素染液染色40 min,蒸馏水冲洗。在倒置相差显微镜下(200x)对迁移至微孔膜下层的细胞计数。　　 八、恩度对U251体外形成VM的作用　　 在上述(七)相同的培养条件下,加入已稀释的浓度为2000μg/ml、1000μg/ml、500μg/ml的恩度工作液100μl,使恩度终浓度分别为1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml,同时设置对照孔,即只接种细胞,不加入恩度药物,每个样本重复3次。置37℃、5％CO2、饱和湿度条件下的细胞培养箱中培养48 h。在倒置相差显微镜下(100x)对细胞小管形成情况进行图像观察及采集。　　 九、Real time RT-PCR检测细胞VE-Cadherin和EphA2 mRNA的表达　　 收集待测细胞,进行RNA抽提并测定OD260/OD280,反转录后按下列条件在荧光定量PCR仪上扩增:95℃,90sec,1个循环:95℃,5sec、58℃,30sec和72℃,4min,45个循环。最后计算mRNA的相对表达量。每个样本设3个复孔。　　 十、Western blot检测细胞VE-Cadherin和EphA2蛋白的表达　　 收集待测细胞,各组细胞进行蛋白质提取后,-70℃保存备用。配制浓缩胶及分离胶,上样后120V电泳1-2h,NC转膜2-2.5h,5％脱脂奶粉封闭1h,加一抗(1:500),4℃过夜,二抗(1:1000)室温孵育1h,ECL发光,测定灰度值。　　 实验结果：　　 一、星形细胞瘤组织中VM形态　　 双重染色的星形细胞瘤组织切片内可见,大部分瘤组织内的血管为经典的机体血管,由CD34染色阳性的内皮细胞和PAS染成樱桃红色的基底膜构成。部分切片内可见由CD34染色阴性的细胞和基底膜组成的管腔样结构,其内有红细胞,此即为拟态血管。按照方法三标准,由3名病理诊断医师独立阅片,共发现8例患者存在血管生成拟态现象,其中7例为胶质母细胞瘤,1例为间变型星形细胞瘤患者。　　 二、VM和临床资料间的关系　　 VM在星形细胞瘤中的发生率分别为,弥漫型星形细胞瘤0(0/30),间变型星形细胞瘤5％(1/20),胶质母细胞瘤27％(7/30)。7例有VM胶质母细胞瘤患者的中位生存期是8.6个月,而没有VM的23例患者的中位生存期是13.4个月;19例没有VM间变型星形细胞瘤患者的中位生存期是32.7个月,1例有VM间变型星形细胞瘤患者在手术后14个月死亡。　　 三、细胞三维培养的形态观察　　 当在Matrigel上培养48 h后,人脐静脉内皮细胞形成管状、网络状等典型的血管腔样结构,高度恶性的胶质母细胞瘤细胞系U251也能够形成相似的血管腔样结构;而正常的大鼠脑胶质细胞和低度恶性的星形细胞瘤细胞系SHG44则在相同培养条件下不能形成血管腔样结构。　　 四、恩度对星形细胞瘤细胞增殖的抑制作用　　 随着药物浓度增加,恩度对U251细胞和SHG44细胞增殖抑制作用有所提高;同时,随着加药处理时间延长,抑制率也存在升高的趋势。药物浓度为250、500、1000μl/ml作用时间为24 h时,对U251细胞的增殖抑制率分别为15.42％、23.75％和32.32％,对SHG44细胞的增殖抑制率为14.63％、18.10％、28.19％。　　 五、恩度对星形细胞瘤细胞侵袭的抑制作用　　 当作用24 h时,随着药物浓度的增加,细胞侵袭数量明显减少,细胞侵袭能力下降。在药物浓度为250、500、1000μg/ml时,对U251细胞的侵袭抑制率分别为57.51％、83.74％和88.53％,对SHG44细胞的侵袭抑制率为43.26％、70.84％和80.09％,同时细胞出现变圆、状态变差情况。　　 六、恩度对U251体外形成VM的作用　　 经恩度作用48h后,随着药物浓度的增加,人脐静脉内皮细胞在Matrigel上形成的血管腔样结构逐渐减少,当浓度为1000μg/ml时,不能再形成管腔结构。而U251细胞经恩度加药处理后,网状连接稍有破坏,但管状结构依然存在,各浓度没有显著差异。　　 七、细胞VE-Cadherin和EphA2 mRNA及蛋白的表达　　 Real time RT-PCR检测细胞VE-Cadherin和EphA2的mRNA表达量和Westernblot检测细胞蛋白表达量结果相似。VE-Cadherin在U251和HUVECs中高表达,在SHG44和正常胶质细胞中几乎不表达;EphA2在星形细胞瘤细胞系U251和SHG44中高表达,在HUVECs和正常胶质细胞中低表达。　　 八、恩度对细胞VE-Cadherin和EphA2表达的抑制作用　　 恩度作用24后,随着药物浓度的增加,星形细胞瘤细胞系U251和SHG44中EphA2的表达量逐渐降低;HUVECs中VE-Cadherin的表达量也随着药物浓度的增加而降低,但恩度对U251细胞VE-Cadherin的表达没有明显抑制作用。　　 结论：　　 1、人星形细胞瘤组织中存在血管生成拟态现象。　　 2、人肿瘤组织和体外培养均提示,血管生成拟态与肿瘤分化有关,分化越低,越可能存在VM。　　 3、血管生成拟态的出现预示星形细胞瘤预后不良。　　 4、恩度在体外有效抑制星形细胞瘤细胞系U251、SHG44的增殖和侵袭,可能是通过下调细胞EphA2的表达实现的。　　 5、恩度在体外显著抑制内皮细胞形成的血管样结构,但不能有效抑制星形细胞瘤细胞系U251形成的VM样结构,可能与对VE-Cadherin表达的调控相关。　　 6、EphA2与细胞的恶性转化有关,而VE-Cadherin参与了星形细胞瘤细胞形成VM。　　 7、恩度强烈的抗肿瘤作用可以通过两种方式实现:抗肿瘤血管新生作用和直接的抗肿瘤细胞作用,但恩度体外抗VM作用是有限的。