论文部分内容阅读
糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病患者的严重并发症之一,是导致失明的重要原因,但DR的发病机制仍在探讨中。临床发现高度近视患者即使有较长的糖尿病病史,也常常不伴有DR的发生;而且在同一糖尿病患者屈光参差的双眼中,近视程度较高眼的DR病变程度比对侧眼明显较轻。国内外已有的研究表明,近视的严重程度与DR的严重程度呈负相关,但缺乏相应的实验学依据。因此,进行高度近视对DR的阻滞机制研究对DR的发病机制及治疗有着重要的意义。由于视网膜小动脉无交感神经支配,因此血管内皮细胞通过释放NO松弛血管平滑肌,同时释放ET-1收缩血管,NO和ET-1的协调平衡维持着血管的外周阻力和局部血管的舒缩状态,协调着视网膜的血液循环,对DR的发生发展起着越来越重要的作用。本实验拟建立糖尿病联合高度近视眼动物模型,应用免疫组化法测定视网膜脉络膜中ET-1、iNOS蛋白含量及细胞凋亡的表达,初步探讨高度近视对糖尿病视网膜病变阻滞的机制。材料和方法选用出生3天的健康三色豚鼠60只,体重100~130 g,雌雄不限,所有豚鼠排除先天性近视及其它眼疾,将豚鼠随机分为4组,Ⅰ组(对照组)15只,饲养6周后腹腔注射等量空白缓冲液;Ⅱ组(拟建高度近视眼动物模型组)15只,以半透明眼罩行右眼遮盖6周后,腹腔注射等量空白缓冲液;Ⅲ组(拟建糖尿病动物模型)15只,饲养6周后按60mg/kg剂量连续3周左下腹腔小剂量多次注射链脲佐菌(streptozocin,STZ)诱发糖尿病;Ⅳ组(拟建糖尿病合并高度近视眼动物模型组)15只,半透明眼罩遮盖右眼6周后按60mg/kg剂量连续3周左下腹腔小剂量多次注射STZ诱发糖尿病。各组豚鼠右眼结膜囊内滴1%复方托吡咔胺滴眼液3次,间隔10min,带状光检影,以屈光度>-6.00D者为高度近视眼豚鼠模型,腹腔注射STZ3天后,凡空腹血糖≥16.7mmol/L-1及尿糖阳性的豚鼠定为糖尿病豚鼠模型。饲养18周后检测4组豚鼠的体重、空腹血糖、双眼屈光度及眼轴长度,取眼球行视网膜切片HE染色、免疫组织化学染色及TUNEL染色,通过与电脑相连的Biosens Digital Imaging system V1.6高清晰度彩色病理图文分析系统作细胞ET-1蛋白、iNOS蛋白表达的半定量分析,用平均光密度值来表示免疫反应表达程度。结果1.体重及空腹血糖变化比较:正常对照组(Ⅰ组)和高度近视眼组(Ⅱ组)体重明显高于糖尿病组(Ⅲ组)及糖尿病合并高度近视眼组(Ⅳ组),其差异具有统计学意义(P<0.05);Ⅰ组与Ⅲ组、Ⅲ组与Ⅳ组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ组与Ⅳ组空腹血糖明显高于Ⅰ组和Ⅱ组,其差异具有统计学意义(P<0.05),Ⅲ组与Ⅳ组、Ⅰ组和Ⅱ组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2.屈光度及眼轴长变化比较:高度近视眼组(Ⅱ组)和糖尿病合并高度近视眼组(Ⅳ组)屈光度明显高于正常对照组(Ⅰ组)及糖尿病组(Ⅲ组),其差异具有统计学意义(P<0.05);Ⅰ组和Ⅳ组、Ⅰ组及Ⅲ组相比无统计学意义(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅳ组眼轴长明显高于Ⅰ组及Ⅲ组,其差异具有统计学意义(P<0.05),Ⅱ组与Ⅳ组、Ⅰ组和Ⅲ组相比无统计学意义(P>0.05)。3.免疫组化染色:ET-1、iNOS蛋白阳性细胞主要表达于神经节细胞层胞浆和内外丛状层,胞浆着色呈棕黄色。ET-1蛋白的表达:Ⅲ组及Ⅳ组阳性表达高于Ⅰ组及Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ组阳性表达高于Ⅳ组,但差异无统计学意义(P>0.05);Ⅰ组及Ⅱ组之间差异无统计学意义(P>0.05)。iNOS蛋白的表达:Ⅲ组及Ⅳ组阳性表达高于Ⅰ组及Ⅱ组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅲ组阳性表达高于Ⅳ组,差异有统计学意义(P<0.05);Ⅱ组阳性表达低于Ⅰ组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.TUNEL染色:荧光显微镜下凋亡细胞呈橙色荧光。正常组视网膜光感受器细胞极少见到凋亡,糖尿病组凋亡细胞明显增多。结论1.透明眼罩遮盖联合STZ小剂量多次腹腔注射是一种可靠的制备糖尿病合并高度近视眼动物模型的方法。2.ET-1/iNOS通过调节视网膜血流,参与了高度近视对DR发展的早期阻滞。3.糖尿病早期即出现了视网膜细胞凋亡。