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1．背景和目的恶性肿瘤是严重危害人类生命的疾病，其死亡率仅次于心脑血管疾病，且发生率呈逐年上升的趋势。作为肿瘤治疗主要手段的联合化疗虽然有较高的治愈率，但是常引起骨髓抑制、免疫功能低下等副反应，使患者难以坚持治疗，并且化疗药物在治疗过程中出现的原发或继发耐药性已成为目前临床治疗中的难题之一。因此，有必要寻求疗效好、毒副作用小的新的治疗方法和药物。近半个世纪来，运用中药治疗恶性肿瘤，越来越被广大学者和患者接受，是恶性肿瘤综合治疗中的有效手段之一。临床实验证明，中药不仅对化、放疗起减毒、增效的作用，而且有预防肿瘤复发转移，阻断癌前病变及抗肿瘤作用。中药以其无明显毒副作用、药源广泛、价格低廉、应用历史悠久等优点越来越显示出独特的优势，抗肿瘤中成药在临床应用日益广泛。乌骨藤，具清热解毒之功效，近年来研究表明具有显著的抗肿瘤作用：在体外能显著的抑制培养的人肝癌Bel-7404细胞、Hep G2细胞，人胃癌（SGC-7901）细胞；体内能抑制肉瘤W256、肝癌HSC及艾氏腹水癌EAC、网织细胞肉瘤S180、胃癌、P388、小白鼠宫颈癌14(U14)、小白鼠淋巴肉瘤，经文献检索尚未见到乌骨藤制剂有关食管癌体外试验和体内抗小鼠黑色素瘤细胞B16的研究报道，该实验的目的是探讨消癌平注射液（乌骨藤制剂）在体内外对该细胞是否有抗肿瘤作用及其作用机制。本课题观察了消癌平注射液体内抗小鼠黑色素瘤细胞B16活性及体外抗人食管癌EC9706活性，并应用细胞及分子生物学技术探讨了消癌平注射液体内外抗肿瘤作用的可能机制，为其临床应用并扩大其临床适应症提供实验依据。2．方法2．1体外试验2．1．1应用MTT法测定消癌平注射液对EC9706细胞的生长抑制率。实验分为3组：（1）实验组：加入不同浓度的消癌平注射液；（2）阳性对照组：加入顺铂（10μg／mL）；（3）空白对照组加等体积生理赫水。每组设4个平行孔，另设本底对照孔。分别加入EC9706细胞培养48小时，测定生长抑制率，求IC50值。同时，用MTT法绘制经消癌平注射液（15mg／mL）处理的EC9706细胞的生长曲线，同时设空白对照（加等体积的生理盐水）和阳性对照（加等体积顺铂）。2．1．2应用倒置显微镜，丫啶橙染色（荧光显微镜）观察细胞用药前后形态变化，流式细胞仪检测用药前后细胞周期变化，免疫细胞化学法检测CyclinD1表达。2．2体内试验2．2．1建立小鼠黑色素瘤细胞B16肿瘤模型，将荷瘤小鼠随机分为5组，每组10只：消癌平注射液大、中、小剂量组（经腹腔分别注射消癌平注射液0.8g／20g／d、0.4g／20g／d、0.2g／20g／d，连续给药8天）；阳性对照组（经腹腔注射CTX 100mg／kg／d，仅第一天给药）；阴性对照组（经腹腔注射等容量无菌生理盐水，连续注射8天）。观察消癌平注射液对荷瘤小鼠的抑瘤率以及对平均生存时间的影响。2．2．2留取肿瘤组织标本，应用HE染色法对消癌平注射液各剂量组及阴性对照组的肿瘤组织行病理形态学观察，比较有无差异。2．3统计学处理应用统计软件SPSS11.5进行统计学处理，统计方法采用t检验和χ2检验。以α=0.05作为检验水准。3．结果3．1体外试验：消癌平注射液对EC9706细胞生长具有明显的抑制作用3．1．1 40mg／mL，20mg／mL，10mg／mL，5mg／mL浓度的水溶液对EC9706细胞的生长抑制率分别为90.15±2.74％，68.02±3.56％，48.73±1.79％，22.52±2.08％。其OD值与空白对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。其IC50值为10.89±1.05mg／mL。3．1．2从生长曲线上看消癌平注射液（15mg／mL）对EC9706细胞生长有明显的抑制作用，且呈量效依赖关系，与空白对照组相比，OD值差异均有统计学意义（每天两组相比均为P＜0.05）。经顺铂10μg／mL组细胞生长存活率第4天达最低点，随后又有一定回升，部分细胞恢复生长。而经消癌平注射液15mg／mL的细胞则一直处于抑制状态，持续降低至第7天。3．1．3消癌平注射液（浓度为15mg／mL）作用于EC9706细胞48小时后，倒置显微镜下可看到细胞皱缩变形、凋亡小体等典型的凋亡细胞形态特征。3．1．4荧光显微镜下丫啶橙染色细胞核或细胞质内可见致密浓染的黄绿色染色，甚或见黄绿色碎片的典型凋亡细胞形态特征。3．1．5用各浓度消癌平注射液作用食管癌EC9706细胞48h，流式细胞仪检测示：10mg／mL、20mg／mL、40mg／mL作用后G0／G1期分别为、59.56±1.73％、86.68±2.57％、83.26±1.86％，与阴性组G0／G1期细胞百分数（55.86±2.06％）比较显著增加（P＜0.05）。3．1．6用兔抗人CyclinD1单抗作免疫组化见EC9706细胞胞核、胞浆均未着色，而阳性对照组细胞胞核着色，呈棕黄色细颗粒状，少部分细胞有胞核、胞浆同时着色，经重复4次实验，结果一致。3．2体内试验：消癌平注射液对小鼠黑色素瘤细胞B-16具有体内抑瘤效应3．2．1消癌平注射液高、中、低剂量组及阳性对照组抑瘤率分别为33.21％，25.78％，15.15％，83.76％，与阴性对照组比较，低剂量组差异无统计学意义（P＞0.05），消癌平中、高各剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）；用药各组间差异有统计学意义（P＜0.05），抑瘤率呈剂量依赖性。3．2．2消癌平注射液高、中、低剂量组及阳性对照组荷瘤鼠的平均生存时间（27.7天、25.3天、22.8天、31.3天）明显长于阴性对照组荷瘤鼠的平均生存时间（20.0天），差异具有统计学意义（P＜0.05）；各剂量组间差异有统计学意义（P＜0.05），生存时间呈剂量依赖性。3．2．3 HE染色组织病理学观察可见消癌平注射液处理组有较多的肿瘤坏死区以及凋亡细胞。4．结论（1）消癌平注射液对EC9706食管癌细胞具有显著的抗肿瘤作用，且呈明显的量效关系，其IC50值为10.89±1.05mg／mL。（2）消癌平注射液可诱导EC9706细胞凋亡。（3）消癌平注射液可阻滞EC9706细胞周期于G0／G1期，从而抑制增殖。（4） EC9706细胞在蛋白水平不表达CyclinD1。（5）消癌平注射液对小鼠黑色素瘤细胞B-16具有体内抑瘤效应，可延长荷瘤鼠的平均生存时间。