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泛素-蛋白酶体通路（Ubiqutin-Proteasom pathway）是近年来发现的一种蛋白质代谢途径,介导了多种蛋白质的降解,与细胞的转化、肿瘤的发生、神经系统褪行性病变、免疫应答和炎症反应均有着密切的关系。在泛素激活酶（E1）和泛素结合酶（E2）协同下,泛素连接酶（E3）将泛素与底物蛋白共价结合,当靶蛋白质被连接数个（通常多于4个）泛素分子后,即被蛋白酶体26S水解。Pirh2 （P53 induced RING-H2 protein）是E3家族中的新成员,由p53诱生,反过来又发挥泛素连接酶的功能使p53发生多聚泛素化而被蛋白酶体水解,形成典型的负反馈环。游离状态的pirh2不稳定,自身亦可被泛素化而被蛋白酶体水解,组蛋白乙酰转移酶TIP60（Tat-interactive protein of 60 kDa）可与其N端结合形成复合物使其稳定。目前发现pirh2在乳癌、前列腺癌、及肺癌组织中高表达（主要定位于胞浆）,而在正常组织中不表达或低表达。然而,有学者在p53阴性表达的骨肉瘤细胞系Saos2及酵母菌中同样检测出了高水平的pirh2,提示必定作用于除p53以外的底物。为此本课题首先采用免疫组织化学方法检测出pirh2在肺癌中呈过度表达状态,继而应用RNA干扰技术下调其在肺腺癌细胞株A549细胞中的表达,观察pirh2这一新的癌基因在肺癌细胞生长中的作用,旨在为基因治疗提供新的思路。最后再构建携带完整pirh2基因序列的真核表达载体,观察pirh2对细胞周期素依赖性激酶抑制因子p27 RNA和蛋白质水平的影响,初步探求p53以外的pirh2泛素化底物。本试验主要分为三个部分:第一部分免疫组化法检测Pirh2和P27kip1在肺癌组织中的表达收集我院1998年至2004存档的53例肺癌和17例癌旁组织石蜡标本,制成4μm切片,应用免疫组织化学SABC法检测pirh2和p27kip1蛋白的表达,并对其所在肺癌组织不同病理类型、分化程度、转移和临床分期中的表达水平进行统计学分析。结果发现,pirh2和p27Kip1蛋白在肺癌组织中均有表达,但是前者位于胞浆,表达率为79.2%,P27Kip1蛋白定位于胞核,呈低表达,为22.6%,二者与癌旁组织相比,差异具有显著性意义（P<0.01）。统计学分析提示pirh2和p27Kip1与肿瘤的病理类型、组织学分级、淋巴结转移和TNM分期均无明显相关关系（P>0.05）。然而我们在分析二者之间相关性时发现,pirh2阳性表达的肺癌组织中,p27Kip1的检出率明显低于pirh2阴性标本,其中存在明显的负相关。由此可见,pirh2在肺癌中高表达,而p27Kip1蛋白呈低表达,二者之间的负性相关提示介导抑癌蛋白p27Kip1泛素化降解可能是pirh2促进肿瘤形成的途径之一。第二部分短发夹状RNA下调Pirh2表达对A549细胞生长的影响为进一步探讨pirh2在肺癌发生中的作用,我们构建了短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）,并观察其对A549细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。将两条人工合成的阵对pirh2基因（670～690和760～780）位点的shRNA序列克隆于psiRNA-hH1-neo质粒中命名为psiRNA-Pirh2A和psiRNA-Pirh2B,同时设计阴性对照（psiRNA-Con）,分别稳定转染A549细胞。试验分为正常对照组、psiRNA-hH1空载体组、阴性对照psiRNA-Con组以及psiRNA-Pirh2A和psiRNA-Pirh2B组。Realtime-PCR和Western blotting分别用于检测各组细胞pirh2 RNA和蛋白水平的变化,以CCK-8法检测各组细胞的增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期转变情况。结果发现,本课题构建的两条针对pirh2的RNA干扰质粒特异性地抑制了A549细胞pirh2的表达;与此相应,细胞的增殖能力明显下降,细胞凋亡率增加,且位于G0/G1期的细胞较对照组显著增加,出现明显的细胞周期阻滞。所以,pirh2有望成为肺癌基因治疗领域里的又一靶点,针对其设计的shRNA在体外成功的抑制了肺癌细胞的生长,但有关在体内的抑癌效应仍需要在以后的研究中进一步探讨。第三部分Pirh2真核表达载体的构建及其对A549 P27kip1基因的影响为进一步探讨pirh2在肿瘤调控网络中的作用,本课题构建携带其基因全部编码序列的真核表达载体,并验证其表达产物对p27 RNA和蛋白质水平的影响。首先常规培养肺腺癌系细胞A549和原代培养人脐静脉内皮细胞,采用免疫荧光技术检测pirh2和p27Kip1在其中的表达。提取A549细胞中的总RNA,逆转录成cDNA作为模版,PCR扩增出pirh2基因全部序列,并连接至真核表达载体pIRES2-GFP,命名为pIRES2-pirh2。分别转染入A549细胞和人脐静脉内皮细胞,Realtime-PCR和Western blotting分别检测两种细胞株中p27 RNA和蛋白质水平变化。双酶切产物电泳发现Pirh2基因编码序列被成功克隆至的真核表达质粒pIRES2-GFP中,命名为pIRES2-pirh2。DNA测序证明插入的基因没有发生任何突变或缺失。将其转染A549及脐静脉内皮细胞后,pirh2蛋白水平均有不同程度的升高,相反,p27蛋白水平却呈下降趋势。由此可以得出结论,真核表达质粒pIRES2-pirh2可在体外产生有生物活性的pirh2蛋白;p27可能是继p53之后又一pirh2泛素化底物。