研究背景非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD),最早是由Ludwing在1980年提出,是一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。它包括单纯性脂肪肝(甘油三酯过量堆积)以及由其演变的脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH,以脂肪变性、肝细胞损害、小叶炎症为特征)和肝硬化甚至肝细胞癌。NAFLD目前是最普遍的肝脏疾病,它的发病率与越来越多的超重和肥胖的人密切相关。在不同国家中NAFLD的发病率约占10%～24%,而在肥胖人群中,其发病率已高达75%。在我国NAFLD已成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病,其肝纤维化的发生率高达25%,其中约1.5%-8.0%的患者可发展为肝硬化,尤其是肥胖患者NASH的发病率可上升至58%～74%。然而,NAFLD目前还没有具有稳定效果及副作用小的理想的治疗药物。因此,寻找有效的NAFLD防治药物成为当今面临的重要课题。NAFLD的发病机制极其复杂,目前最为认可的仍是“二次打击”学说。第一次打击是肝脏游离脂肪酸和肝细胞甘油三酯的沉积,即脂肪变性。第二次打击是脂肪变性进展为脂肪性肝炎,这个进展与氧化应激、线粒体功能障碍、炎性细胞因子、纤维化和坏死等因素有关。细胞因子的升高、氧化应激的介导和脂质过氧化被认为在诱导脂肪性肝炎中起重要作用。肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor-α, TNF-a)和白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)是发展为许多形式肝损伤的重要细胞因子。NAFLD始于肝脏的脂质堆积,因此,研究脂质代谢机制成为一个重要的方向。在脂质代谢中,固醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Proteins, SREBPs)发挥脂质合成作用,脂联素(Adiponectin)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)和过氧化物酶体增殖物活化受体α(peroxisome proliferator-activated receptors a, PPARa)发挥脂肪酸氧化作用。脂联素具有调节能量平衡、脂肪代谢、抗脂肪变性、抗炎等生理活性；AMPK在调节能量代谢和脂肪酸氧化方面具有关键性作用；PPARa是一个高表达于肝脏的核受体,能够对参与脂肪酸氧化、吸收和炎症的基因发挥转录作用。此外,脂联素可以通过激活AMPK和PPARa通路,抑制SREBP-lc而起作用；AMPKa活化后则可通过下调转录因子SREBP-lc的表达而抑制参与甘油三酯合成和积累的脂肪生成基因如ACC的表达。脂联素还可以抑制TNF-a和IL-6的产生,反之TNF-a和IL-6也可以抑制脂联素的表达。有研究报道脂联素、AMPK、PPARa敲除的大鼠可发展成肝脂肪变性,而脂肪肝患者血清脂联素、AMPK、PPARa水平偏低。目前尚无疗效理想的NAFLD治疗药物。护肝清脂片,来源于南方医科大学珠江医院名老中医的经验方,临床主要用于脂肪肝的防治,由泽泻、山楂、蒲黄、荷叶、三七、陈皮等6味中药组成。护肝清脂片临床上使用历史悠久,在改善NAFLD患者血生化指标、恢复正常体重等方面具有确切的效疗。本课题组前期实验表明,护肝清脂片能明显改善非酒精性脂肪肝模型大鼠的肝指数、血脂和增强抗氧化能力。进一步的机制研究表明其可通过激活AMPK和PPARa信号通路改善L02和HepG2细胞模型中的肝脂肪变性。为进一步明确及剖析护肝清脂片的作用机制,本文选取该制剂组方中主要中药泽泻、山楂和荷叶各自所含的主要活性成分泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷叶碱为研究对象,以脂肪变性HepG2细胞为模型,详细探讨其在脂质代谢过程中的药效及可能的作用机制。泽泻醇A-24-醋酸酯具有降胆固醇、抗炎和抗糖尿病的作用但无有关非酒精性脂肪肝的报道；熊果酸具有保肝抗炎、降血糖、抗氧化、降血脂等多种药理活性,有研究表明其可改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝大鼠的脂肪变性和脂质代谢紊乱；荷叶碱也可以预防高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝仓鼠的肝脂肪变性、脂质代谢障碍和肝损伤。因此,我们假设泽泻醇A-24醋酸酯、熊果酸和荷叶碱对NAFLD的脂质代谢影响及可能的相关机制。目的本文采用游离脂肪酸(FFA)(油酸与棕榈酸的混合物,油酸：棕榈酸＝2：1)诱导HepG2细胞建立脂肪变性细胞模型,旨在研究护肝清脂片中主要活性成分泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷叶碱对非酒精性脂肪肝脂质代谢的影响及可能机制,以进一步明确护肝清脂片发挥临床疗效的主要物质基础。研究方法以人肝癌HepG2细胞为研究对象,给予含不同浓度的泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷叶碱的培养基培养24h,通过MTT法测定细胞活性,筛选药物的最佳作用浓度。本研究实验随机分为正常组(Con)、模型组(FFA)、泽泻醇A-24-醋酸酯组(FA)、熊果酸组(FU)、荷叶碱组(FN)、非诺贝特组(FF)。正常组HepG2细胞用含1%BSA的培养液培养24h,模型组HepG2细胞用1mMFFA处理24h,药物组HepG2细胞分别用含终浓度为10μM的泽泻醇A-24-醋酸酯、80μM熊果酸、50μM荷叶碱、10μM非诺贝特和终浓度为1mM FFA培养液一起孵育24h。采用油红O染色法观察不同组别细胞形态和细胞内脂滴形成情况,并测定其脂质含量。同时采用试剂盒检测细胞内TG含量；酶联免疫吸附法(Elisa)检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和Adiponectin的含量。RT-PCR测定Adiponectin mRNA、AMPK mRNA、SREBP-lc mRNA、ACC mRNA和PPARa mRNA的表达情况；Western blot测定p-AMPKα、SREBP-1、p-ACC和PPARa的蛋白表达情况。结果1.泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷叶碱的浓度与HepG2细胞的活性呈剂量依赖关系。HepG2细胞被药物孵育24h后,随着药物浓度的增大细胞活性降低。当泽泻醇A-24-醋酸酯为10μM,熊果酸为80μM,荷叶碱为50μM时,各自的存活率分别为91.5%、89.5%和87.2%。2.油红O染色结果显示模型组细胞出现严重肝脂肪变性,存在大量红色脂滴,泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷叶碱和非诺贝特组细胞内红色脂滴数目明显减少。模型组脂质含量明显高于正常组(p<0.01),泽泻醇A-24-醋酸酯、荷叶碱和非诺贝特能显著降低肝脂肪变性HepG2细胞内脂质含量(p<0.05或p<0.01),熊果酸能降低脂质含量但无统计学差异。此外,模型组细胞内TG含量也明显高于正常组(p<0.01),泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷叶碱和非诺贝特均能显著降低肝脂肪变性HepG2细胞内TG含量(p值均为0.01)。3. Elisa结果显示模型组炎症因子TNF-a和IL-6的水平显著增加(p<0.01),泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷叶碱均能逆转肝脂肪变性HepG2细胞的TNF-a和IL-6水平的增加(p值均小于0.01)。而非诺贝特不能显著降低肝脂肪变性HepG2细胞的TNF-a和IL-6的水平(p<0.05)。4.与正常组相比,模型组中Adiponectin mRNA和细胞培养上清液中Adiponectin分泌蛋白的表达量均显著降低(p<0.01),泽泻醇A-24-醋酸酯和非诺贝特在mRNA和分泌蛋白水平上均能显著上调肝脂肪变性HepG2细胞Adiponectin的表达(p<0.01,p<0.05)；熊果酸和荷叶碱在mRNA水平上未能上调肝脂肪变性HepG2细胞Adiponectin的表达(p<0.05),但在分泌蛋白水平上可上调其表达(p<0.05,p<0.01)。5.与正常组相比,模型组中AMPK mRNA的表达显著减少,ACC mRNA和SREBP-lc mRNA的表达显著增多(p<0.01)；泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷叶碱能显著下调肝脂肪变性HepG2细胞ACC mRNA和SREBP-lc mRNA的表达,上调AMPK mRNA的表达(p<0.05,p<0.01)；非诺贝特只下调肝脂肪变性HepG2细胞ACC mRNA和SREBP-lc mRNA的表达,未表现出对AMPKmRNA表达的上调作用。在蛋白水平上,与正常组相比,模型组中p-AMPKa的表达水平显著降低(p<0.01),而p-ACC和SREBP-1的表达水平则显著升高(p<0.05,p<0.01)；泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸、荷叶碱和非诺贝特均能显著升高肝脂肪变性HepG2细胞p-AMPKa的表达水平(p<0.01),降低p-ACC和SREBP-1的表达水平(p<0.05,p<0.01)。6.与正常组相比,模型组中PPARα mRNA和蛋白的表达量均显著降低(p<0.01)；熊果酸、荷叶碱和非诺贝特均能显著升高肝脂肪变性HepG2细胞PPARa mRNA和蛋白表达水平(p<0.01),而泽泻醇A-24-醋酸酯对PPARa的表达无影响(p>0.05)。结论1.10μM泽泻醇A-24-醋酸酯,80μM熊果酸,50μM荷叶碱对细胞活力影响均在90%左右,为最佳作用浓度。2.泽泻醇A-24-醋酸酯、熊果酸和荷叶碱均能明显减少脂肪变性HepG2细胞的脂质堆积,并抑制TNF-a和IL-6的产生；非诺贝特能明显减少脂肪变性HepG2细胞的脂质堆积,但未表现出抑制TNF-a和IL-6产生的作用。护肝清脂片所含三种活性成分中,以泽泻醇A-24-醋酸酯的效果最好。3.泽泻醇A-24-醋酸酯能上调肝脂肪变性HepG2细胞Adiponectin的表达,并能上调AMPK的表达,及下调SREBP-lc和ACC的表达,熊果酸、荷叶碱和非诺贝特能上调肝脂肪变性HepG2细胞Adiponectin的表达,并能同时上调AMPK和PPARa的表达,及下调SREBP-lc和ACC的表达,从而达到调控脂质代谢的药理作用,这可能是护肝清脂片发挥防治非酒精性脂肪肝临床疗效的主要物质基础和作用机理。