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多环芳烃是一类在环境中有广泛分布的有机化学污染物,具有“三致”(致畸、致突变、致癌),通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。微生物的降解与转化是消除PAHs污染的有效方式。研究降解菌的遗传控制、探索代谢途径、解析相关酶系和功能基因,从而构建基因工程菌株用于污染环境的生物修复是当前的研究热点。
本论文对一株从Ulsan海湾(韩国)沉积物中筛选到的高效PAHs降解菌Novosphingobium pentaromativorans US6-1对菲、芘和苯并芘(三环至五环PAH)降解特性、差异表达蛋白质组、关键酶基因表达等方面进行了较为系统的研究,获得的主要结果如下:
1.GC-MS结果显示,新鞘氨醇菌US6-1能高效降解3-5环PAHs,经过24h,36h和48h后对起始浓度为10ppm的菲、芘和苯并芘的降解率分别可达到86.62％,31.81％和22.18％;
2.在双向电泳(2D-E)分离差异表达蛋白前对N.pentaromativorans US6-1全蛋白提取和电泳过程中的主要影响因子进行了优化,结果表明:以变性剂为7M尿素/2M硫脲,还原剂DTT为20mM,上样量为150μg,最大聚焦电压为8,000V时能获得理想的蛋白图谱;
3.通过功能蛋白组学分析和串联质谱鉴定,发现了在PAHs诱导下N.Pentaromativorans US6-1产生了的包含PAHs降解,转运和调节因子,碳代谢,氨基酸代谢,核苷酸代谢,特殊功能蛋白和未知功能蛋白在内的七大类功能蛋白;
4.根据环羟基化双加氧酶α亚基和4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的基因序列信息设计特异性引物,采用反转录实时PCR分析发现这两个基因的表达在不同底物诱导下均有不同程度的上调;
5.N.pentaromativorans US6-1在通过环羟基化双加氧酶开环后经一系列的酶作用后,经3-氧代乙二酸通路中的水杨酸或者邻苯二甲酸支路生成TCA循环的中间代谢物进入TCA循环并最终降解成H2O和CO2。