棉花是我国重要的经济作物,棉纤维是在纺织行业中使用最多的天然纤维,具有巨大的应用价值。棉纤维由胚珠外珠被表皮细胞突起而形成,是一个极度伸长的单细胞,它的生长发育过程可分为四个相互独立但又有部分重叠的时期:纤维起始期、伸长期、次生壁合成期和脱水成熟期。棉花纤维的细胞伸长期和次生壁合成期较长,是研究细胞伸长和次生壁合成的理想材料。同时,纤维细胞的伸长期和次生壁合成时期决定了成熟纤维的产量和品质,研究棉纤维的发育及调控是解析纤维产量和品质形成机理的重要环节,将为培育高品质棉花提供理论基础。转录因子是真核生物基因转录的主要调控蛋白,可以结合到基因的启动子、增强子,或者其他的调控区域,通过与RNA聚合酶Ⅱ的直接或间接相互作用,调节相关基因的转录水平。鉴于转录因子在基因调控中的重要功能,转录因子一直是分子生物学研究的热点,解析转录因子在棉纤维发育过程中的功能和作用机制是一项基本内容,也是对棉纤维发育过程和性状进行分子调控和改良的重要基础和靶点。通过前人文献报道和前期VIGS实验等结果,初步得到转录因子GhMYB201基因可能参与及棉花纤维伸长机制的调控。所以本研究的目标在于利用棉花不同组织的转录组数据鉴定棉花纤维发育过程中特异或优势表达的转录因子基因,通过生物信息学分析、表达分析和VIGS分析等方法鉴定转录因子GhMYB201在棉花纤维发育中的功能,为进一步解析棉花纤维发育过程中基因调控网络及其转基因调控奠定基础。主要结果如下:1.GhMYB201的功能定位及生物信息学分析根据前期的转录组和VIGS数据,得到了在棉花纤维发育时期表达水平较高的转录因子基因GhMYB201。为了验证其是否为转录因子,通过构建的特异载体瞬时表达成熟烟草叶片,两天后进行荧光观察。通过共聚焦显微镜800倍放大倍数下的亚细胞定位图发现,从亚细胞定位图显示可以观察到GhMYB201基因定位于细胞核中,初步判断GhMYB201基因应该为转录因子。同时,GhMYB201同源基因序列比对分析显示含有共同的R2-MYB、R3-MYB两个MYB类结构区域以及M1、M2和M3三个功能结构区段。2.GhMYB201的表达分析GhMYB201相关基因进行系统进化分析显示,GhMYB201有3个MYB类同源基因,分别为GhMYB192、GhMYB201和GhMYB105,通过对GhMYB201基因的不同同源基因进行q-PCR分析,发现GhMYB201基因的D亚家族表达水平是最高的,其中在纤维快速伸长期的纤维中高表达,在其他组织器官中表达较低;在胚珠纤维不同发育时期,GhMYB201的表达水平随着纤维的伸长逐渐升高,在10DPA(Day Post Anthesis)左右达到峰值,随后逐渐下降。该结果表明GhMYB201在棉纤维的发育和伸长过程中具有重要作用。GhMYB201在棉花的各个组织中均有表达,其中纤维最高,叶片和萼片次之。3.GhMYB201转录激活活性检测根据GhMYB201包含的5个功能区段,将含有不同区段序列构建到p GBKT7BD载体上,进行酵母双杂交自激活检测,验证发挥功能的主要功能区域。前期酵母双杂交实验显示,R2R3+M2,M1+M2+M3,Full length有自激活现象,结合分析初步显示M2区域可能为GhMYB201基因发挥功能的主要区域。单独将M2区域及M2区域敲除的序列连接到p GBKT7 BD载体上,进行酵母双杂交自激活检验,验证互作区域。结果显示还有M2区域的载体有自激活现象,而不含M2区域的空载及M2区域序列敲除的载体没有自激活现象,证明GhMYB201发挥功能的主要区域是M2区域。4.抑制GhMYB201基因表达抑制转基因纤维伸长GhMYB201基因在纤维细胞快速伸长期优势表达,可能与纤维伸长有密切关系。构建了含有GhMYB201和YFP的VIGS载体注射棉花,通过VIGS技术沉默GhMYB201基因,发现沉默棉花纤维伸长期特异表达的转录因子基因GhMYB201,棉花纤维中对应的GhMYB201基因的表达水平更低,相应的棉花纤维长度更短,说明GhMYB201基因对棉花纤维的伸长具有促进作用,进一步通过构建不同载体进行棉花遗传转化验证。5.改变GhMYB201的表达水平影响棉花植株的生长发育对敲除材料表型分析发现,敲除材料较野生型相比植株生长较缓慢,植株更矮小,花、花瓣、萼片均变小,叶片颜色深绿,开花后无法稳果。同时叶片、叶柄、初生嫩叶的表皮毛更短。从敲除材料看出敲除GhMYB201基因的植株表皮毛变短,推测可能对棉花纤维也有同样影响,目前正等待棉铃爆开进一步验证。6.GhMYB201可通过对激素ABA的响应影响棉花纤维的伸长。ABA是一类天然的植物激素,对植物各个发育时期都有影响。本实验意在通过胚珠培养探究ABA是否对GhMYB201基因的表达产生影响,从而最终导致棉花纤维的伸长发育受到影响。通过不同浓度剃度的ABA应激处理,检测表达量分析,不同浓度梯度的ABA会对GhMYB201基因的表达水平产生影响。在一定范围的浓度内,ABA浓度的升高会导致棉纤维GhMYB201表达水平的提高,棉纤维的长度也会相应增长;当ABA的浓度达到一定值时,棉纤维的长度会随着ABA浓度的增加而降低,过量的ABA甚至会抑制棉花纤维的发育。这表明ABA浓度的变化会对GhMYB201的表达水平产生影响,从而影响棉纤维的发育。