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研究背景:慢性肾脏疾病(CKD)是世界上影响人类健康的慢性病之一,目前对慢性肾脏病的诊断仍缺乏有效手段。近年来研究表明,尿液信使RNA(messenger RNA,mRNA)检测可能成为CKD早期无创诊断的有效手段。我们通过生物信息学和基因表达芯片的筛查,发现了一系列可能的CKD相关尿液mRNA诊断标志物。然而,既往基于SYBR两步PCR检测尿液mRNA的方法耗时耗力,限制了对候选标志物大样本的临床验证。本研究旨在构建一种基于Taqman探针荧光定量PCR一步试剂盒,提高尿液mRNA标志物的检测效率、敏感性、特异性,并通过临床样本验证和性能评价,构建CKD尿液mRNA一步法检测试剂盒,发现CKD新型诊断标志物。方法:应用生物信息学技术筛选CKD患者差异表达mRNA,从中选取三个mRNA基因,分别是PODXL、IL1RL1和CCL2。根据目的基因ID,在NCBI上下载PODXL、IL1RL1、CCL2、以及B2M(内参基因)基因全序列,并构建基于Taqman探针的CKD相关基因检测荧光定量一步法试剂盒,对试剂盒进行敏感性及重复性检验以检测试剂盒性能。筛选符合条件的受试者,收集受试者尿液样本,应用所建试剂盒检测受试者尿液PODXL、IL1RL1及CCL2 mRNA水平并评估标志物的诊断效能。结果:通过对基因组平台大数据库的综合分析,我们构建了常见慢性肾脏病如糖尿病肾病、高血压肾病、局灶节段性肾小球硬化、膜性肾病和IgA肾病等的转录组学表达谱,发现了176个肾小球相关慢性肾脏病差异表达基因、50个肾小管相关差异表达基因。通过对PCR实验中各体系组分及反应条件优化,我们构建的TaqMan探针一步法荧光定量试剂盒可实现尿液中PODXL、IL1RL1和CCL2以及B2M(内参基因)四种mRNA有效扩增及定量检测。经过一系列的重复性及敏感性验证,发现本试剂盒的变异系数小于0.5%,检测性能较稳定,可从0.5ng/10ul体系的尿沉渣mRNA中检测相应mRNA表达水平,灵敏度较好。整个扩增定量全过程在一小时内完成,与传统的两步法PCR方法相比减少了检测时间。应用构建的Taqman探针一步法试剂盒对既往所筛选的差异基因进行临床验证,发现DKD患者的尿液PODXL mRNA、IL1RL1 mRNA和CCL2 mRNA水平高于正常对照组(HC)。GN(慢性肾小球肾炎)患者三种基因表达水平和正常组相比无差异。HC组和DKD III期、IV期组尿液PODXL mRNA、IL1RL1 mRNA表达水平有显著差异。而HC组和DKD各期间CCL2 mRNA表达水平无差异。DKD患者的尿液PODXL mRNA、IL1RL1 mRNA和CCL2 mRNA表达水平和eGFR、血肌酐无相关性,和24小时尿蛋白、ACR呈显著的正相关。PODXL区分DKD和对照组的ROC曲线下面积AUC为0.7879(p<0.0001)(特异性为87.5%,敏感性为61.22%、IL1RL1的AUC为0.8249(p<0.0001)(特异性为93.75%,敏感性为59.18%)、CCL2的AUC为0.7181(p=0.001)(特异性为81.25%,敏感性为57.14%)。结论:本研究所构建的基于TaqMan探针的实时荧光定量一步法试剂盒对尿液基因表达检测具有较好的敏感性、特异性和可重复性;该试剂盒用于CKD尿液mRNA标志物大样本检测,发现尿液PODXL、IL1RL1和CCL2 mRNA可能成为DKD新型诊断标志物。