氧化葡萄糖酸杆菌醇脱氢酶的功能揭示及其选择性氧化二元伯醇合成羟基醛的研究

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zjundu1980
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
羟基醛是一类具有醇和醛的双重性质的化合物,在有机合成领域及医药等工业应用广泛。鉴于目前化学合成过程存在反应条件苛刻、污染大、产物选择性低、副产物多、产率不高等问题,亟待开发绿色、高效的生物催化方法生产羟基醛。要实现羟基醛的高效生物合成,筛选具有高区域选择性和高活性的酶或微生物是关键。本论文基于对氧化葡萄糖酸杆菌中醇脱氢酶的挖掘和催化功能的研究,建立了针对疏水性羟基醛(如水杨醛)的全细胞催化体系和针对水溶性好的羟基醛(如乙二醇)的酶催化体系,并对反应条件进行了考察。  首先,确定了氧化葡萄糖酸杆菌的细胞膜和细胞质中都存在可催化二元伯醇生成对应的羟基醛的醇脱氢酶。其中,膜结合的乙醇脱氢酶对多种脂肪族和芳香族的二元伯醇、烯醇都具有比较高的氧化活性,且对二元伯醇上的羟基具有严格的区域选择性,只氧化其中的一个伯位羟基生成相应的羟基醛。相比而言,细胞质中存在的醇脱氢酶的底物谱比较窄。同时,氧化葡萄糖酸杆菌细胞膜和细胞质中也存在多个醛脱氢酶,会将羟基醛进一步氧化成羟基酸。  其次,以水杨醇作为模式底物,利用敲除了膜结合乙醛脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌全细胞催化,在异辛烷-缓冲溶液组成的两相体系中,实现了水杨醛的较高浓度的积累。在优化的条件下,20g(wet wt)/L静息细胞在8h内可将100mM水杨醇转化完全,产物水杨醛的得率为98.7%。对于疏水性的醛的合成,有机溶剂-水两相体系的使用,有效地阻断了醛的进一步氧化。  第三,根据文献报道和生物信息学分析、以及催化活性的鉴定,确定了氧化葡萄糖酸杆菌胞内的NAD(H)依赖的乙醇脱氢酶GOX0313能够选择性氧化二元伯醇生成相应的羟基醛,不能氧化羟基醛,但在NADH存在时可催化羟基醛的还原生成二醇。通过对其在E.coli BL21中的异源表达、纯化,得到了重组酶GOX0313,酶学性质研究表明GOX0313是一个Zn2+结合的乙醇脱氢酶,属于中链醇脱氢酶/还原酶家族,天然状态下是同源四聚体。伴随Lactobacillus brevis ATCC367的NADH氧化酶-2(NOX-2)催化的辅酶NAD+再生反应,在水溶液中,0.5U的GOX0313可催化10mM乙二醇,产物乙醇醛的产率为97.8%,当底物浓度提高到50mM时,产物得率降为84.6%。GOX0313和NOX-2,特别是后者,在反应体系中的快速失活是导致产率降低的主要原因。为了提高酶的稳定性,构建了GOX0313和NOX-2串联表达的E.coli工程菌,利用全细胞催化乙二醇生成乙醇醛,20g(wet wt)/L全细胞催化10mM乙二醇,8h内积累了7.31mM乙醇醛,产物得率为73.1%。
其他文献
目前新能源汽车行业中的电动汽车领域取得了突飞猛进的进步,与其相关的能源,环保,交通等高科技新兴工业蓬勃发展,电动汽车成为推动国民经济不断进步增长的核心产业之一。目前,我国
人转化生长因子(TGFβ1)cDNA克隆在原核生物表达质粒pBLMVL2,受P启动子控制,在大肠杆菌中进行温敏诱导表达.表达产物经计算机灰度扫描约占全菌蛋白的20%.Western blot分析证
鉴于非恒定流对船舶航行安全影响在航道设计中有十分重要的意义,文章总结了非恒定流对船舶航行影响的研究成果,综合论述了非恒定流在航道水位,航道水流流速,航道河床演变,船
G93-1、G93-2、G93-3和G93-4株病毒是1993年用A549细胞从广州地区4名散发性戊型肝炎(HE)病人急性期粪便中分离.近年来,在病毒的形态学、PCR扩增及核酸杂交方面初步鉴定为HEV.
目前在工业生产和社会生活中需要广泛的负载速度调节,经济性优越的永磁耦合式调速技术有着越来越广阔的应用前景。基于永磁涡流耦合调速技术,本文研究一种新型的永磁涡流联轴器
在利用克雷伯肺炎杆菌产1,3-丙二醇的过程中,2,3-丁二醇合成途径的阻断对于1,3-丙二醇工业化生产具有极其重要的意义。然而,2,3-丁二醇合成途径的阻断却会使细胞内氧化还原平衡被打