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由乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染导致的慢性乙型肝炎（Chronichepatitis B, CHB）为世界范围内的传染性疾病，与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。HBV感染诱发机体产生以细胞毒性T细胞（cytotoxict lymphocyte，CTL）特异性免疫应答为主的多种抗病毒免疫反应。当病毒不能有效清除而持续复制，将会导致HBV感染慢性化，发展为慢性乙型肝炎，其主要原因可能是HBV特异性CTL的免疫应答减弱。CTL的免疫功能缺失与抑制性受体分子的上调表达、抑制性细胞因子的产生、抗原递呈失调以及调节性T细胞（T regulatory, Treg）的负性调控有关。Treg主要亚群的表面标志为CD4~+CD25~+，胞内表达的Foxp3是其特异功能性分子。研究表明CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg可对多种免疫细胞发挥抑制效应，通过抑制HBV特异性的CD4+和CD8+T细胞的活性，使病毒得不到彻底清除而持续感染，导致乙型肝炎的慢性化。Treg的增殖及其免疫抑制功能与表面共刺激分子的表达有关。共刺激分子受体通过与其相应配体相互作用，介导正性或负性共刺激信号，调节T细胞的增殖、细胞因子的产生、细胞毒性以及细胞的凋亡和存活等来控制T细胞的活化。BTLA与PD-1都是免疫球蛋白超家族的负性共刺激受体分子，分别与其配体HVEM和PD-L1相互作用产生负性共刺激信号，抑制T细胞的活化、增殖及其免疫学功能。研究表明PD-1介导的负性共刺激信号通路在慢性丙肝病毒（Hepatitis C virus, HCV）感染患者中，通过抑制Treg的信号转导及转录激活因子的磷酸化，阻断IL-2的作用，从而负性调控Treg的增殖，但PD-1在CHB患者Treg的表达特性及其对Treg的调控作用目前尚无报道。此外，BTLA和HVEM在Treg上的表达特性、对Treg的调控作用、BTLA/HVEM变化对Treg的影响及其在CHB中的意义目前也尚未见报道。本研究通过流式细胞术检测了CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg在慢性乙肝患者中的比率及其表面负性共刺激分子PD-1、PD-L1、BTLA、HVEM的表达特性，并分析了Treg数量与慢性乙肝临床指标的相关性，以及分析了Treg表达的上述负性共刺激分子与临床指标的相关性，探讨了PD-1、BTLA/HVEM对Treg的调节作用和PD-L1参与构成Treg的抑制性功能，及其对HBV慢性感染的影响，从而初步揭示了负性共刺激分子在Treg的表达特性及其意义，为临床诊断提供有价值的指标。一、慢性乙肝患者CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg与其表面PD-L1的检测及其与临床指标相关性的分析【目的】通过检测慢性乙肝患者外周血CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg占CD4+T细胞的比率，及其表面PD-L1的表达水平，并分析其与临床指标的相关性，探讨Treg及PD-L1作为Treg抑制性功能分子对慢性乙肝的影响。【方法】采用ELISA检测乙型肝炎e抗原（HBeAg）等血清标志；采用荧光定量PCR法检测HBV DNA；采用罗氏全自动生化分析仪检测肝功能的指标；分离人外周血淋巴细胞，对CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg荧光标记后通过流式细胞术检测，并用GraphPad Prism5.0软件对数据进行统计分析。【结果】慢性乙肝患者外周血CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg占CD4+T细胞的比例显著高于健康人（P <0.05），并与慢性乙肝患者血清ALT及AST呈现正相关（P <0.05），但与HBV-DNA载量无较好的相关性；PD-L1在慢性乙肝Treg中的表达较健康人显著上调，且与Treg比率、肝损伤的血清标志物ALT、AST均呈显著的正相关，与HBV DNA没有显著相关性。【结论】慢性乙肝患者外周血Treg数量的增加并与肝损伤指标呈正相关性，这可能是由于其对HBV特异性CTL的免疫抑制作用的增强，从而使HBV持续感染并继续恶化；PD-L1在CHB患者Treg上调表达并与Treg比率及肝损伤指标呈正相关，其可能参与了Treg对HBV特异性CTL的免疫抑制功能，有利于病毒的持续感染，促进慢性乙肝的发生发展。二、负性共刺激分子PD-1、BTLA和HVEM在慢性乙肝患者CD4~+CD25~+FoxP3+Treg的表达特性及其与临床指标相关性的分析【目的】通过分析PD-1、BTLA和HVEM在CHB患者CD4~+CD25~+FoxP3+Treg的表达及其与Treg数量及临床指标的相关性，探讨PD-1/PD-L1、BTLA/HVEM对Treg的负性调控作用及其变化对慢性乙肝的影响，为临床诊断和干预奠定理论基础。【方法】分离人外周血单个核细胞，采用4色荧光标记和流式细胞术检测CD4~+CD25~+FoxP3~+Treg表面PD-1、BTLA与HVEM的表达，利用Flowjo软件分析流式测定结果，及采用GraphPad Prism5.0软件对数据进行统计分析。【结果】PD-1在慢性乙肝Treg中的表达较健康人显著下调且与Treg比率、肝损伤的血清标志物ALT、AST均呈显著的正相关，与HBV DNA没有显著相关性；BTLA和HVEM在慢性乙肝Treg中的表达较健康人显著下调，且BTLA与HVEM的表达水平呈正相关，与Treg比率、PD-1、PD-L1及肝损伤的血清标志物ALT、AST均呈显著的正相关，与HBV DNA没有显著相关性。【结论】PD-1的慢性乙肝患者Treg的表达下调可能有助于乙肝患者体内Treg的扩增；BTLA和HVEM的表达也呈现同步下调，其与PD-1负性信号可能协同参与了对Treg的调控作用，该负性共刺激分子与肝损伤指标呈相关性的免疫学作用机理则尚待进一步探讨。综上所述，本研究初步阐明了CHB患者外周血Treg占CD4+T细胞的比率增加；Treg表达的负性共刺激分子PD-1、BTLA/HVEM相对于健康人呈下调，但随着Treg数量的增加逐步上调，且与肝损伤指标呈正相关性；PD-L1在CHB患者呈现上调，且与Treg比率、肝损伤指标呈正相关性；从而表明负性共刺激分子PD-1、BTLA/HVEM可能参与了对Treg自身的调控，PD-L1可能构成了Treg抑制性功能的表面分子之一，并对慢性乙肝的发展产生了影响。