[研究背景]慢性光化性皮炎(chronic actinic dermatitis,CAD)是一组免疫介导的光敏性皮肤病。该病主要好发于中老年男性,在日照时间长、紫外线(ultraviolet,UV)强的高原地区尤为明显。皮损常发生于曝光部位,临床表现为面、颈、双手等曝光部位出现红斑、丘疹、结节伴瘙痒,严重者可发展为皮肤T淋巴瘤,成为慢性、迁延一生的疾病,给患者带来沉重的心理负担和精神压力。CAD的病因和发病机制仍不清楚,治疗效果有限。因此,探索新的发病机制对于CAD的治疗具有重要意义。长期以来,有学者提出CAD与免疫功能紊乱所诱发的迟发型超敏反应(Delayed type hypersenitivity,DTH),氧化应激和角质形成细胞(keratinocyte,KC)异常凋亡等有关。除了这些以外,炎症在CAD发生发展过程中也发挥重要作用。其中,UV诱导的炎症反应参与CAD发病的多个环节,在CAD发病机制中一直受到广泛关注。有研究报道大于2倍最小红斑剂量(minimum erythema dose,MED)的UVB辐射可致CAD出现明显炎症浸润。UVB还可通过作用于KC,朗格汉斯细胞(Langerhans cell,LC)和T细胞等免疫细胞诱导炎性细胞因子发生变化进一步产生免疫抑制作用,从而引起KC损伤,产生炎症反应。KC作为皮肤免疫细胞的重要组成部分,与CAD炎症密切相关,但UVB诱导KC炎症反应参与CAD发病的机制仍不清楚。近年来,也有研究发现CAD患者皮损处经皮水份流失(transepidermal water loss,TEWL)增加,证实CAD中存在皮肤通透屏障受损。角质层(stratum corneum,SC)和紧密连接(tight junctions,TJ)是构成表皮通透屏障功能的主要结构,对维持正常皮肤通透屏障功能(epidermal permeability barrier function,EPB)起到重要作用。角质层中细胞不可逆地向终末分化过程中,角蛋白表达发生变化,其中K5和K14表达下调,K1和K10表达上调。丝聚合蛋白(filaggrin)、兜甲蛋白(loricrin)、内披蛋白(involucrin)等组装最终形成角化套膜(CE),然后以“砖墙”结构的方式密封并通过与脂质结合在一起形成EPB的结构基础。细胞间脂质结构脂质的合成与颗粒层中的板层小体密切相关,在丝氨酸棕榈酰转移酶(Serine Palmitoyl Transferase,SPT)、脂肪酸合成酶(Fatty Acid Synthetase,FASN)、三羟基三甲基戊二酰辅酶A(Hydroxymethylglutaryl-CoA Reductase,HMGCoA)等的作用下,板层小体内含丰富的脂质合成和水解酶,可以合成脂质。TJ由不同类型的跨膜蛋白和胞质蛋白组成。跨膜蛋白主要有闭锁蛋白(occludin),水闸蛋白(claudins)多基因家族和连接黏附分子(JAM);胞质蛋白主要有闭锁小带蛋白(ZO)-1等。目前认为EPB受损可能与细胞间脂质改变、角化套膜、紧密连接相关蛋白以及角蛋白的异常表达有关。但CAD中EPB受损的具体分子机制还未见报道,CAD中炎症反应和皮肤屏障是否存在相关性仍有待研究。本课题前期通过对CAD组织mRNA表达谱的结果进行分析,主要从影响CAD炎症和表皮通透屏障两方面入手,筛选与之相关差异表达的mRNA,其中与炎症相关差异表达最明显的mRNA是TNFAIP3,与通透屏障相关差异表达mRNA是Occludin。TNFα诱导蛋白3(TNFAIP 3,又叫A20)。A20可作为调控因子控制NF-κB信号传导。NF-κB激活后可以快速诱导其表达,A20通过负反馈回路控制其表达,并产生炎症介质。Occludin是TJ的重要组成部分,主要受蛋白激酶C(PKC)的影响。PKC是一种依赖磷脂的蛋白激酶,通过催化各种蛋白质的磷酸化来调节细胞代谢。已有研究表明,Occludin的异常表达后会导致细胞的TEER增加,影响细胞旁渗透屏障功能。因此,本课题拟在前期CAD全转录组测序结果基础上,从CAD炎症和皮肤通透屏障功能受损两方面入手,找到CAD中与之相关差异表达的目标分子A20和Occludin,重点对A20和Occludin在CAD炎症和通透屏障功能调控中的作用及相互关系进行研究,并探讨A20和Occludin对紫外线介导CAD的炎症和皮肤屏障功能受损中的具体机制,将有助于深入了解CAD的发病机制。[目的]探讨A20参与UVB介导的CAD炎症反应中的作用机制和Occludin致CAD皮肤屏障受损和炎症反应及两者相互关系的研究[方法]第一部分:对前期RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)结果中差异表达的mRNA进行分析,筛选出与CAD炎症相关差异表达最明显的mRNA;收集CAD曝光部位和正常面部曝光部位皮肤组织进行A20免疫组化染色,观察两组A20的表达差异:qRT-PCR检测CAD中与皮肤渗透屏障相关蛋白(Occludin、Cldn1、Cldn5、Cldn7、ZO-1、filaggrin、loricrin、involucrin)及脂质关键合成酶(HMGCR、FAS、SPT)的表达。购买HaCaT细胞株,通过UVB(10-40mJ/cm2,0-72h)照射HaCaT细胞,CCK-8和流式细胞术检测细胞活性和细胞凋亡水平;qRT-PCR和ELISA检测UVB诱导的炎症因子的表达;Western Blot检测UVB对A20表达的影响;然后应用慢病毒稳定敲减或过表达A20转染HaCaT细胞的策略,对A20参与UVB介导的炎症反应的功能作用及机制进行研究;ELISA法检测A20敲减或过表达后炎性细胞因子水平;细胞跨膜电阻仪测量A20和对细胞跨膜电阻值(trans epithellal electric resistance,TEER/TER)的影响;Western Blot检测A20敲减或过表达后对NF-κB 和 MAPK 相关蛋白表达(包括 NF-κB P-P65、p-IkB、MAPK-JNK、ERK、p-38),皮肤渗透屏障相关蛋白及脂质关键合成酶的表达;细胞免疫荧光检测A20敲减或过表达后NF-κB p65入细胞核情况。第二部分:对CAD患者额部皮损及健康对照者同一部位进行皮肤生理功能检测分析。并在前期RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)结果基础上对差异表达的mRNA进行分析,筛选出与CAD皮肤通透屏障相关差异表达最明显的mRNA;收集CAD曝光部位和正常面部曝光部位皮肤组织进行Occludin免疫组化和组织免疫荧光染色,观察两组Occludin的表达差异。在细胞水平,qRT-PCR和ELISA检测UVB诱导的炎症因子的表达;Western Blot检测UVB对Occludin和PKC表达的影响;细胞跨膜电阻测量UVB对细胞TER的影响。然后应用人工合成siOccludin和Occludin过表达质粒转染HaCaT细胞的策略,对Occludin致CAD皮肤屏障受损和促炎反应的作用机制进行研究:ELISA法检测Occludin敲减或过表达后炎性细胞因子水平;细胞跨膜电阻仪测量Occludin对TER的影响;Western Blot检测Occludin敲减角蛋白表达;siOccludin和PKC抑制剂(PKCi)处理HaCaT细胞后,ELISA和细胞跨膜电阻仪分别检测IL-6的分泌和TER有无恢复。[结果]第一部分:CAD中与炎症相关差异表达最明显的mRNA是A20。免疫组化结果显示A20在CAD皮损中表达明显低于正常面部对照皮肤(P<0.05),且表达趋势与RNA-seq结果完全一致。在体外实验中,与对照组比较,UVB照射后的HaCaT细胞中A20表达显著降低(P<0.05)。UVB照射后HaCaT细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的释放增加(P<0.01,P<0.01,P<0.05),IL-10 分泌减少(P<0.05);敲减A20后IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌显著增加(P<0.05,P<0.001,P<0.001),IL-10的分泌减少(P<0.001);A20敲减后NF-κB P-P65和p-IkB的蛋白表达水平增高(P<0.05,P<0.05),NF-κB P-P65入核增多。NF-κB p65抑制剂(BAY11-7082)和A20上调后HaCaT细胞中IL-1β的炎症水平得到部分恢复(P<0.05,P<0.05);A20干扰或过表达后,Occludin、Cldn1、Cldn5、Cldn7、ZO-1、filaggrin、loricrin、involucrin、HMGCR、FAS、SPT,JNK、ERK和p-38表达无明显变化;A20干扰或过表达后,细胞的TEER无明显变化。第二部分:CK检测结果显示,与对照组比较,CAD皮损处TEWL升高CAD中与通透屏障相关差异表达最明显的是Occludin。免疫组化结果显示Occludin在CAD皮损中表达明显低于正常面部对照皮肤(P<0.05),表达趋势与RNA-seq结果完全一致。在体外实验中,与对照组比较,UVB照射后的HaCaT细胞中Occludin表达显著降低(P<0.05),PKC表达增高(P<0.05)。UVB照射后HaCaT细胞中TER下降(P<0.05);敲减Occludin后IL-6水平升高(P<0.05),IL-1β、TNF-α、IL-10 无明显变化(P>0.05,P=0.73;P>0.05,P=0.92;P>0.05,P=1.13)。Occludin敲减后细胞TER下降;FD4渗透性增加,IL-6水平升高;K1表达增加,K5表达下调;促进HaCaT细胞增殖;PKCi能逆转UVB所致Occludin表达下调(P<0.05),PKCi能部分恢复UVB所致TER降低(P<0.05),PKCi能使降低Occludin下调所致IL-6分泌水平增高(P<0.01)。[结论]1.A20在CAD中表达降低;2.A20下调促进炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放,抑制IL-10的分泌,其机制为A20通过负向调控NF-κB促进UVB诱导的炎症反应。3.A20与皮肤通透屏障无明显相关性。4.Occludin在CAD中表达明显下调;5.下调Occludin可降低HaCaT细胞的TER,增加细胞FD4渗透性,增加细胞的IL6水平,促进角蛋白表达异常及细胞增殖;6.UVB可通过激活PKC/Occludin通路影响细胞渗透屏障功能,进一步促进细胞炎症。