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研究目的:本研究拟采用安罗替尼抑制肿瘤血管新生,改善非小细胞肺癌的乏氧微环境,再结合Carbogen气体给予高浓度氧气吸入,再联合同时结合现代放疗技术,研究其对非小细胞肺癌放射治疗敏感性的影响。研究方法:通过安罗替尼联合Carbogen作用于裸鼠成瘤模型后,利用小动物PET-CT的乏氧探针进行检测其肿瘤区域氧合状态的变化,并联合放射治疗作用于裸鼠成瘤模型,然后利用免疫组化方法检测乏氧因子和凋亡因子的表达水平,并在细胞水平通过低氧和常氧联合安罗替尼和放射治疗作用后检测肺癌细胞株A549的增殖和凋亡水平的变化;在临床试验中,安罗替尼和Carbogen共同作用联合放射治疗非小细胞肺癌患者进行评价疗效,最终明确在非小细胞肺癌中安罗替尼联合Carbogen是否能够增加非小细胞肺癌细胞的凋亡进而提高放疗敏感性。研究结论:安罗替尼结合Carbogen可以改善肿瘤微环境,并通过作用于肿瘤细胞引起HIF-1表达下降,并导致凋亡因子Bcl-2表达下降和Caspase3表达升高,抑制肿瘤细胞增殖能力,提升放疗敏感性;三者联合可以提高非小细胞肺癌的放疗敏感性,治疗相关的不良反应临床上患者可以耐受,可以安全用于临床,值得进一步推广和研究。第一部分安罗替尼结合Carbogen吸入对非小细胞肺癌裸鼠放射治疗敏感性的作用及其机制的研究研究目的本研究拟探讨安罗替尼联合Carbogen对肿瘤微环境的影响,及其联合放射治疗在非小细胞肺癌裸鼠成瘤模型中的协同作用。研究方法利用A549细胞株构建非小细胞肺癌裸鼠成瘤模型,联合安罗替尼和Carbogen作用后,通过微型PET检测裸鼠模型肿瘤组织的乏氧改善情况,并对肿瘤组织中乏氧区域进行免疫荧光和放射自显影检测,明确乏氧标记物哌莫硝唑和GULT-1的表达变化,同时在裸鼠成瘤模型安罗替尼和Carbogen联合放疗作用后,制备肺癌病理标本,采用免疫组化检测标本中HIF-1a、Ki-67、凋亡因子Caspase3和Bcl-2的表达水平。研究结果1.本研究成功构建非小细胞肺癌裸鼠成瘤模型,经18F-FDG微型PET检查,安罗替尼联合Carbogen作用组中裸鼠肺癌组织中对于18F-FDG的摄取显著低于空气吸入组(P=0.02),单纯Carbogen吸入组中裸鼠肺癌组织对18F-FDG的摄取也显著低于空气吸入组(P=0.03),而在裸鼠正常组织中,实验组和对照组对于18F-FDG的摄取几乎没有影响;2.免疫荧光检测显示单纯空气吸入后,裸鼠肺癌肿瘤组织区域内乏氧探针哌莫硝唑和GULT-1表达升高,组织乏氧区域显示清晰,而在实验组安罗替尼联合Carbogen吸入组和单纯Carbogen吸入组中,乏氧区域内则出现哌莫硝唑表达下降和GLUT-1表达升高,说明之前的乏氧区域在联合作用和单纯Carbogen作用后,均已经处于氧合状态;3.在放射自显影研究中,安罗替尼联合Carbogen吸入后,裸鼠成瘤模型肿瘤组织中检测18F-FDG的摄取,其摄取量(4.19±1.32%)显著低于空气吸入组的摄取量(9.67±4.35,n=5 mice,P<0.01)。并且,在安罗替尼联合Carbogen组中,肿瘤组织GLUT-1表达高的区域中哌莫硝唑表达降低;4.免疫组化检测结果则显示,在安罗替尼联合Carbogen协同放射治疗组中HIF-1a、Ki-67和Bcl-2的表达水平比单纯放疗组的表达水平显著升高,而凋亡因子Caspase3的表达水平则明显下降。研究结论1.非小细胞肺癌裸鼠成瘤模型中,安罗替尼联合Carbogen作用后能够提升肿瘤乏氧区域氧合状态,可以改善乏氧微环境。2.非小细胞肺癌裸鼠成瘤模型中,安罗替尼联合Carbogen并给与放射治疗后,肿瘤组织中HIF-1α的表达下降,Ki-67表达下降,凋亡因子Bcl-2表达下降和Caspase3表达升高,肿瘤的增殖水平明显减低,放射敏感性得到提升。第二部分安罗替尼结合高氧联合放射治疗对A549肺癌细胞的作用及其机制的研究研究目的本研究为了明确安罗替尼改善乏氧微环境后,不同氧浓度条件培养下的A549细胞株射线敏感性改变的机制。研究方法在A549细胞株低氧培养联合放疗和常氧培养联合放疗,并同时加入安罗替尼作用后,通过MTS和划痕方法检测细胞的增殖水平,并利用流式细胞术检测细胞的凋亡水平,western blot检测细胞中HIF-1a、Ki-67、凋亡因子Caspase3和Bcl-2的表达水平。研究结果1.MTS检测结果显示,在常氧24h+放疗4Gy+安罗替尼组的细胞增殖水平最低,而在单纯低氧组的细胞增殖水平最高(P=0.01);2.在划痕实验中,结果发现与常氧24h+放疗4Gy+安罗替尼组相比较,对照组低氧24h的细胞划痕生长速度最快,而常氧24h+放疗4Gy细胞划痕生长速度也快于常氧24h+放疗4Gy+安罗替尼组;3.流式细胞术检测分析,结果显示与低氧24h+放疗4Gy+安罗替尼组细胞的凋亡水平相比较,常氧24h+放疗4Gy+安罗替尼组的晚期凋亡率显著增高(P<0.05);4.Western blot检测结果显示,在常氧24h+放疗4Gy+安罗替尼组中Caspase3表达降升高,HIF-1a、Ki-67和Bcl-2的表达水平均下降。研究结论安罗替尼和高氧联合使A549细胞放射治疗敏感性提高机制之一,可能是二者相互作用改善肿瘤微环境后,使非小细胞肺癌A549细胞的HIF-1表达下降,并导致凋亡因子Bcl-2表达下降和Caspase3表达升高,导致增殖能力下降。第三部分安罗替尼结合Carbogen联合放射治疗局部晚期非小细胞肺癌的临床观察研究目的本临床研究,拟观察安罗替尼结合Carbogen联合三维适形放疗是否能够提高非小细胞肺癌患者局控率和近期疗效。研究方法50例病理确诊的Ⅲ期非小细胞肺癌老年患者,随机分为实验组(安罗替尼结合Carbogen联合放疗)和对照组(Carbogen联合放疗)。两组患者均接收处方剂量:60-66Gy/30-33次,相同标准的三维适形放疗,并且自放射治疗计划开始实施起,每次放射治疗前5min开始给予Carbogen气体吸入,至放射治疗结束停止,吸入时间为15±6min,设置气体流量10L/mi。安罗替尼用法:实验组患者按照推荐剂量12mg/次,每日1次,早餐前口服,连续服药2周,停药1周。研究结果所有入组患者全部完成预定治疗及随访。在治疗结束3个月、和6个月时,实验组和对照组之间的CR分别是52%和24%,60%和32%(p<0.05),总有效率分别为84%和48%,84%和56%(p<0.05)。本研究得出Carbogen联合放疗PR增敏比为1.35,CR增敏比1.2。实验组在30-40Gy之间,两组的消退率相差不大,但50-60Gy时,二者的消退具有统计学意义,说明实验组的局控率更好。不良反应的观察,结果未见明显的肝、肾和神经毒性反应,心脏毒性未观察到Ⅲ级及以上反应,临床未观察到Ⅳ级不良放疗反应。血压升高在实验组高于对照组,但经加强降压治疗,继续完成放疗;手足综合征在对照组未出现。胃肠道反应两组相似。研究结论1.安罗替尼和Carbogen联合放射治疗非小细胞肺癌能够提高局控率、PR率和CR率,提示二者联合应用能够提高非小细胞肺癌的放射治疗敏感性。2.安罗替尼结合Carbogen联合放射治疗临床应用于老年非小细胞肺癌患者时,安罗替尼自身副作用高血压及手足综合征经过积极处理可以耐受,但治疗过程中需要密切关注。