目的了解志贺杆菌对轮状病毒感染后的影响及其可能的发生机制。探究轮状病毒和志贺杆菌共感染的动态变化,为进一步了解志贺杆菌与轮状病毒感染之间的相互作用奠定基础,为预防和治疗轮状病毒感染提供更多的方案。方法1、构建轮状病毒感染新生乳鼠腹泻模型:将10窝SPF级昆明系5日龄乳鼠进行分组:实验采用SPF级昆明小鼠同窝繁育,对照组乳鼠5窝（NC）,实验组乳鼠5窝（RV）。NC组乳鼠每天每只灌胃PBS 100μL;RV组乳鼠每天每只灌胃10~6 PFU/m L的SA11株轮状病毒100μL。乳鼠连续灌胃4天后收集直肠粪便,通过16s r DNA测序检测粪便菌群。2、分离与鉴定志贺杆菌:收集轮状病毒感染新生乳鼠腹泻模型的粪便,通过SS平板、革兰染色、克氏双糖铁、五糖发酵管、血清学鉴定及16s r RNA测序等方法分离鉴定志贺杆菌并确认志贺杆菌的生长曲线;3、检测志贺杆菌对Caco-2细胞紧密连接蛋白的影响:采用不同浓度的志贺杆菌感染Caco-2细胞不同的时间,通过台盼蓝染色法确定对Caco-2细胞的细胞毒性;通过实时荧光定量PCR和Western blotting法检测志贺杆菌的侵袭浓度、侵袭时间对Caco-2细胞紧密连接蛋白claudin-1和Occludin的相对表达情况;4、构建志贺杆菌培养上清与轮状病毒体外共培养模型:通过CCK8检测志贺杆菌培养上清对Caco-2细胞的细胞毒性,确定其最适浓度;并通过CCK8法与实时荧光定量PCR法检测志贺杆菌培养上清与轮状病毒共培养模型对Caco-2细胞的影响;在确保细胞数量无显著性差异的情况下,通过实时荧光定量PCR法、免疫荧光和流式细胞术检测志贺杆菌培养上清对轮状病毒体外复制的影响;5、构建志贺杆菌培养上清与轮状病毒体内共培养模型:将15窝乳鼠随机分为对照组（NC）3窝和耗竭组（KW）12窝,并将耗竭组（KW）分为志贺杆菌组（Shigella）4窝、轮状病毒组（RV）4窝和轮状病毒+志贺杆菌组（RV+Shigella）4窝。采集各组粪便提取RNA,采用实时荧光定量PCR法检测各组VP6基因拷贝数。6、志贺杆菌抑制轮状病毒可能机制的研究:（1）首先,志贺杆菌上清与轮状病毒SA11共培养12h;以轮状病毒SA11分别作为阳性对照,不做任何处理的细胞为阴性对照;提取各组RNA和蛋白,采用实时荧光定量PCR法和western blotting检测各组干扰素调节因子-1的相对表达量;（2）将志贺杆菌上清与轮状病毒SA11在4℃环境共培养1h来达到抑制病毒吸附的目的,每隔15min摇晃一次以确保吸附均匀,以轮状病毒SA11为阳性对照,不做任何处理的细胞为阴性对照,通过实时荧光定量PCR法、免疫荧光和流式细胞术检测志贺杆菌培养上清对轮状病毒吸附阶段的影响。结果1、成功构建轮状病毒感染新生乳鼠腹泻模型:16S r DNA测序结果显示RV组与NC组的微生物组成有显著差异,筛选到10个差异性菌属。其中志贺杆菌属的丰度增加最为明显;2、成功分离乳鼠轮状病毒感染模型肠道志贺杆菌:菌落在SS琼脂培养基上生长良好,且呈现圆形、无色、微凸、半透明、边缘较齐的形态,直径约为0.5-2μm;该菌革兰染色呈现阴性,呈现短杆形态。在双糖铁培养基斜面不变色,底部为黄色,并且穿刺线明显;并对乳糖呈现阴性,对葡糖糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇呈现阳性。在血清玻片凝集试验中,载玻片上出现了沙粒状或片状为志贺杆菌。测序结果显示本研究中的分离株（Gen Bank No.PRJNA804371）与数据库中志贺杆菌16s r RNA序列同源性为99%,根据上述生化鉴定、血清学鉴定和测序结果,确定该菌株为志贺杆菌。3、志贺杆菌对Caco-2细胞紧密连接蛋白的影响:采用不同梯度稀释的志贺杆菌混合液分别对Caco-2细胞进行不同时间的处理,当不同浓度的志贺杆菌侵袭≤4 h时,2组Caco-2细胞存活率比较差异无统计学意义（P＞0.05）,各组细胞存活率均达80%以上;实时荧光定量PCR与Western blotting结果显示:与对照组（NC）比较,当不同浓度的志贺杆菌侵袭3 h时,Caco-2细胞中Claudin-1和Occludin m RNA与蛋白的表达显著下降（P＜0.01）;与对照组相比,当志贺杆菌浓度为1×10~6 CFU/m L侵袭3h时,胞内Claudin-1和Occludin m RNA和蛋白表达水平开始明显下降（P＜0.05）。4、志贺杆菌培养上清对轮状病毒体外复制的影响:采用不同MOI值的志贺杆菌感染Caco-2细胞,随着MOI值的减少,细胞毒性随之减少,在MOI=0.01时,志贺杆菌感染Caco-2细胞12h时,细胞毒性减少至6%。采用不同梯度的志贺杆菌培养上清感染Caco-2细胞,随着梯度的增加,细胞毒性随着减少,在稀释度为100时,志贺杆菌感染Caco-2细胞12h、24h时,细胞毒性均小于5%。采用CCK8法和实时荧光定量PCR法检测共培养时细胞数量,与RV组相比,RV+supernatant组细胞数量无显著性变化（P＞0.05）。通过实时荧光定量PCR、免疫荧光法和流式细胞术检测志贺杆菌培养上清对轮状病毒体外复制的影响,结果表明,RV组病毒基因拷贝数为6.30×10~10 copies/m L,病毒滴度为1.705×10~6FFU/m L;RV+supernatant组病毒基因拷贝数为4.27×10~10 copies/m L,病毒滴度为0.59×10~6 FFU/m L;流式细胞术检测结果显示RV组约9.3%的细胞感染轮状病毒,RV+supernatant组约0.59%的细胞感染轮状病毒。综合以上结果:与RV组相比,RV+supernatant组病毒量相对减少,差异均有统计学意义,表明志贺杆菌培养上清可以减少轮状病毒的感染。5、成功构建志贺杆菌与轮状病毒体内共培养模型:与NC组相比,KW组细菌量明显减少,这表明乳鼠菌群损耗模型鼠成功构建。抗生素处理三天后,连续灌喂志贺杆菌和轮状病毒SA11 6天后,与KW-RV组相比,KW-Shigella-RV组志贺杆菌含量明显增加了100%,表明志贺杆菌回归模型构建成功。通过实时荧光定量PCR检测各组VP6基因拷贝数,结果显示:与KW-RV组（2.140×107copies/m L）相比,KW-Shigella-RV组病毒拷贝数减少到2.155×10~6 copies/m L（P＜0.01）。6、志贺杆菌抑制轮状病毒可能分子机制的研究:（1）通过实时荧光定量PCR法和western blotting检测各组IRF-1的m RNA与蛋白的表达量,结果显示:与NC组相比,RV组IRF-1因子m RNA的相对表达量下降了50%（P＜0.001）,RV+supernatant组IRF-1因子m RNA与蛋白的相对表达量相对升高了60%（P＜0.001）,supernatant组IRF-1因子m RNA与蛋白的相对表达量明显升高了100%（P＜0.001）。表明志贺杆菌培养上清可能通过增加IRF-1因子的表达来抑制轮状病毒的复制。（2）通过实时荧光定量PCR、免疫荧光和流式细胞术检测志贺杆菌培养上清对轮状病毒吸附阶段的影响,结果显示:与RV组相比,RV+supernatant组对轮状病毒的吸附量减少了约40%（P＜0.001）,表明在志贺杆菌上清与轮状病毒SA11共培养过程中,志贺杆菌上清抑制了轮状病毒的吸附过程。结论1、成功从轮状病毒感染新生乳鼠腹泻模型中分离得到志贺杆菌（PRJNA804371）;2、志贺杆菌能够减少肠上皮细胞紧密连接蛋白Claudin-1和Occludin的表达;3、志贺杆菌培养上清可以减少轮状病毒体内外的复制;4、志贺杆菌培养上清减少轮状病毒复制的可能分子机制如下:（1）可以通过增加干扰素调节因子1的表达量来抑制轮状病毒的复制;（2）可以通过抑制轮状病毒的吸附阶段来抑制轮状病毒的复制。