【摘 要】
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目的探讨糖尿病导致血脑屏障损伤后,CD8+T细胞浸润海马并释放颗粒酶B（Granzyme B,GZMB）诱导海马神经元凋亡和认知功能损害的作用机制。方法将成年雄性C57BL/6小鼠分成五组,每组10只,分别分为正常组（CON）、糖尿病组（DM）、颗粒酶B抑制剂组（DM+Serpin A3N）,Netrin-1过表达组（DM+AAV-Netrin-1）,空载体对照组（DM+Vector）。除CON组
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目的探讨糖尿病导致血脑屏障损伤后,CD8+T细胞浸润海马并释放颗粒酶B（Granzyme B,GZMB）诱导海马神经元凋亡和认知功能损害的作用机制。方法将成年雄性C57BL/6小鼠分成五组,每组10只,分别分为正常组（CON）、糖尿病组（DM）、颗粒酶B抑制剂组（DM+Serpin A3N）,Netrin-1过表达组（DM+AAV-Netrin-1）,空载体对照组（DM+Vector）。除CON组外,其余小鼠按150 mg/kg剂量的STZ腹腔注射建立糖尿病模型,造模成功后,DM+Serpin A3N组按尾静脉注射5 mmo L/kg剂量的Serpin A3N,DM+AAVNetrin-1组通过脑立体定位注射5μL Netrin-1过表达病毒,DM+Vector组通过脑立体定位注射5μL的空病毒载体。采用MWM测试小鼠的学习记忆能力。伊文斯蓝染色检测血脑屏障的通透性。尼氏染色海马区神经元数量变化。TUNEL法检测海马神经元凋亡。免疫荧光检测CD3和CD8共定位,GZMB和CD8共定位,GZMB和Neu N共定位,Netrin-1和Neu N共定位。Western blot检测GZMB,CD8,Netrin-1,Caspase3,Cleaved Caspase-3蛋白表达水平。结果与CON组相比,DM组血糖升高,体重降低,差异均有统计学意义（P＜0.01）。MWM实验结果显示,与CON组相比,DM组逃避潜伏期时间显著延长（P＜0.01）,与DM组相比,DM+Serpin A3N组和DM+AAV-Netrin-1组逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05）,与CON组相比,DM组小鼠穿越平台次数明显减少（P＜0.01）,与DM组相比,DM+Serpin A3N组和DM+AAV-Netrin-1组穿越平台次数明显增多（P＜0.05）,与CON相比,DM组在平台所在象限时间百分比减少（P＜0.01）,与DM组相比,DM+Serpin A3N组和DM+AAV-Netrin-1组在平台所在象限时间百分比增多（P＜0.01）。伊文思蓝检测显示DM组海马伊文思蓝渗漏（P＜0.01）,海马区红色荧光增多。免疫荧光显示DM组海马区CD3+CD8+T细胞增多,GZMB与CD8+T细胞共定位,GZMB与Neu N共定位,Netrin-1与Neu N共定位减少。尼氏染色结果表明,与CON组相比,DM组海马神经元减少（P＜0.01）,与DM组相比,DM+Serpin A3N组和DM+AAV-Netrin-1组小鼠海马区神经元增多（P＜0.01）。TUNEL染色表明,与CON组相比,DM组阳性细胞数目增多（P＜0.01）,与DM组相比DM+Serpin A3N组和DM+AAV-Netrin-1组阳性细胞数目均减少（P＜0.01）。Western blot实验表明,与CON组相比,DM组CD8,GZMB,Caspase3,Cleaved caspase3含量均增多（P＜0.01）,Netrin-1水平降低（P＜0.05）。与DM组相比,DM+Serpin A3N组和DM+AAVNetrin-1组GZMB,Caspase3,Cleaved caspase3表达降低（P＜0.01）,Netrin-1表达增高（P＜0.05）。结论糖尿病引起血脑屏障破坏后外周CD8+T细胞浸润海马,CD8+T细胞释放的GZMB通过调控Netrin-1的水平变化影响海马神经元凋亡。Serpin A3N和过表达Netrin-1能阻止海马神经元的凋亡,改善小鼠学习记忆功能。
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