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蓝舌病( Bluetongue , BT)是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起,由库蠓传播的反刍动物的一种烈性传染病。反刍动物感染蓝舌病后的病死率约为30%,其中绵羊的病死率高达80%,给畜牧业造成巨大损失。蓝舌病是世界动物卫生组织(OIE)规定的上报疾病(以前为A类传染病),我国将其列为一类动物疫病。蓝舌病病毒基因组含有10个双股RNA片段(dsRNA),分别编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3和NS3a),7种结构蛋白中的4种形成双层蛋白衣壳,外壳主要由VP2和VP5构成,而内壳主要由VP3和VP7构成。VP7蛋白比较保守,携带有群特异性抗原决定簇,能刺激被感染机体产生强的群特异性免疫反应,因此,VP7基因已成为蓝舌病病毒研究的热点。本研究在克隆并鉴定蓝舌病病毒VP7基因的基础上,进行VP7蛋白的原核表达,并制备了相应的单克隆抗体,为今后进一步开展蓝舌病病毒诊断研究奠定了基础。1.蓝舌病病毒VP7蛋白的原核表达及重组蛋白反应原性的鉴定根据GenBank中已知的BTV-1型病毒VP7基因序列设计并合成一对引物。利用RT-PCR方法扩增编码群特异性抗原的VP7基因片段。经核苷酸序列测定,克隆的基因片段长1050bp,为VP7基因开放性读码框的全长序列,编码349个氨基酸。将VP7基因片段连接至pMAL-c2X表达载体中,阳性克隆质粒在TB1大肠埃希氏菌感受态细胞中经IPTG诱导表达,筛选到高表达重组载体pMAL-VP7。按pMAL融合蛋白纯化系统说明书用直链淀粉树脂对融合表达的VP7蛋白进行纯化。SDS-PAGE、Western blotting和ELISA试验表明,表达蛋白为融合蛋白,分子量约为90ku,具有良好的群特异反应原性。2.蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体制备及鉴定本研究通过BHK-21细胞接种增殖蓝舌病病毒,经二次差速离心进行浓缩和提纯,将收获的病毒液用0.1%甲醛灭活。用纯化病毒免疫6周龄Balb/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。用ELISA试验筛选阳性株,采用有限稀释法对其进行克隆,经过融合共获得2株能稳定分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2C8和7D5H4。细胞培养上清ELISA效价分别为1×105和1×104,腹水ELISA效价可达1×108和1×107。所有单抗特异性良好,与背景源蛋白无交叉反应。