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背景支气管哮喘是一类由多种免疫细胞参与的慢性炎症性气道疾病,可发生于任何年龄。近年来,越来越多的研究发现,支气管哮喘患者体内存在着一群非T非B的免疫细胞,即固有淋巴细胞(innate lymphoid cells, ILCs)。此类细胞不表达任何谱系的标志,但是其具备类似T淋巴细胞的功能。根据与此类细胞相关的转录因子、表而表达的受体以及其活化后分泌的特征性细胞因子,可将ILCs分为三类,包括ILC1s、ILC2s和ILC3s。在健康个体体内,ILCs的量微乎其微,而在病理状态下可被活化而比例增加。支气管哮喘发作时,活化的ILC2 s分泌IL-13、IL-5等细胞因子,维持Th2极化状态,参与免疫损伤。在这些促炎细胞因子的作用下,使气道局部呈现气道高反应性,形成典型的哮喘症状。ROR α,是维甲酸相关的孤核受体家族的成员之一,其在各种生物体的多种组织均有表达。作为ILC2s的特征性转录因子,RORα在ILC2s分化增殖过程中以及功能的发挥方面发挥重要作用。目前的研究发现,当小鼠缺失ROR α时,其体内ILC2s的数量减少,并且对于寄生虫的免疫能力减弱。而缺乏ILC2s的小鼠经过继转移ILC2s,则小鼠的ILC2s功能可获重建。目的为了探讨ROR α于支气管哮喘发生发展中的作用,为临床哮喘病的治疗寻找新的途径。本研究在建立哮喘小鼠模型的基础上,分析ILC2s在模型鼠的分布,并经构建ROR α表达载体研究其对ILC2s的调控作用,探讨用于干预哮喘模型鼠的可能性。旨在为ROR α的应用研究奠定理论依据和试验基础。材料与方法(1)临床病例分析:流式细胞术检测支气管哮喘患者外周血单个核细胞中ILC2s的比例;RT-qPCR方法检测外周血单个核细胞中RORα、T-bet、GATA3、IL-33、IL-25、IL-13、IL-5、IL-4 的 mRNA 表达水平;ELISA 法测定血清中的IL-33、IL-13、IL-5的蛋白含量;直线回归法分析RORα的mRNA表达水平与ILC2s活性的相关性、RORα的mRNA表达水平与Th1、Th2细胞相关分子的相关性、ILC2s的特征性细胞因子mRNA表达水平与Th2细胞特征性细胞因子的相关性。(2)小鼠哮喘模型的诱导和ROR α表达载体的体内干预试验:1)构建RORα表达载体:无菌分离小鼠脾脏组织,运用RT-PCR从小鼠脾脏组织的mRNA中克隆出mROR α全长编码区的cDNA,并将该cDNA连接到PMD-18T载体,同时鉴定该载体序列。再定向克隆入腺病毒的穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP,并与骨架载体PBHGloxdetalE1, 3Cre一同于HEK293内包装,并纯化腺病毒。2)小鼠哮喘模型的诱导及RORα表达载体的干预:建立OVA诱导的支气管哮喘模型。利用Ad-ROR α干预后。运用H&E染色的方法观察肺组织病理学的变化;流式细胞仪分析模型鼠外周血ILC2s细胞比例;用细胞计数池计数BALF中炎症细胞的浸润情况;ELISA检测血清IL-33、IL-13、IL-5等细胞因子的含量;肺组织和支气管肺泡灌洗液中RORα、IL-33、IL-13、IL-5、IL-4和GATA3等mRNA表达水平用RT-qPCR法测定、肺组织中ROR α、ST2蛋白的表达以Western-blot 法检测。结果(1)支气管哮喘患者外周血中IILC2s的比例相对于正常对照者明显升高,且血清IL-33以及ILC2s的特征性细胞因子IL-13、IL-5的蛋白含量也随之升高;同时,外周血单个核细胞中 RORα、IL-33、IL-13、IL-5、IL-4、GATA3 的 mRNA表达水平也呈升高趋势,而Th1细胞的转录因子T-bet的mRNA则呈降低趋势。相关性分析结果显示,RORα与ILC2s呈正相关,IL-33亦与ILC2s的特征性细胞因子IL-13、IL-5、IL-4呈正相关。(2)成功克隆了小鼠RORα基因的全长序列,经测序无误。经定向克隆的方法,成功将RORα的全长基因克隆入pDC316-mCMV-EGFP,经过PCR、酶切分析和测序鉴定均无误。(3)腺病毒的包装:成功大量制备了携带小鼠ROR α的穿梭载体pDC316-RORα-mCMV-EGFP、骨架载体 PBHGloxdetalEl,3Cre,随后将穿梭载体 pDC316-RORα -mCMV-EGFP与骨架载体PBHGloxdetalE1, 3Cre 一同转染状态良好的HEK293细胞,经过纯化后,成功地包装出了高滴度的携带小鼠RORα的腺病毒。(4)小鼠哮喘模型的建立:用OVA成功诱导小鼠哮喘动物模型,经模型鼠肺组织H&E染色镜检,可见大量炎症细胞浸润。与OVA组和OVA+Ad-EGFP组相比,Ad-RORα处理的模型鼠,其肺组织中的炎症细胞增多更为明显,且哮喘症状更为明显,出现强烈地抓耳挠腮、抬起前肢、大小便失禁、呼吸急促等哮喘表现。同时,处理组小鼠与未处理的OVA诱模组和Ad-EGFP处理组相比,其支气管肺泡灌洗液中IgE的水平明显增加。(5)哮喘模型中ILC2s相关的因子检测:Ad-RORα处理组循环ILC2s明显高于未处理的模型鼠和Ad-EGFP对照组,提示ILC2s参与的哮喘的发病过程,而转录因子RORα发挥了推波助澜的作用。此外,在Ad-RORα处理组,促进ILC2s活化的IL-33,ILC2s的特征性细胞因子IL-13、IL-5和转录因子GATA3,以及Th2细胞因子IL-4等均明显升高。同时,我们亦发现IL-33蛋白升高,升高的IL-33进一步促进ILC2s的增殖活化。结论哮喘患者机体ILC2s数量及其相关分子表达增加,与此同时,上调的RORα与ILC2s比例呈现明显的正相关关系。成功构建了 Ad-RORα病毒载体,成功建立了 OVA诱导的小鼠哮喘模型,并经体内试验表明了外源性ROR α对哮喘发生发展的免疫病理作用。