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研究背景：高脂肪、高热量膳食结构是造成我国代谢性疾病发病率急剧增加的重要原因之一。而代谢性疾病所导致的涉及多种脏器和组织病理改变及功能受损的慢性并发症受到人们的广泛关注。间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一类来源于中胚层具有自我复制和多向分化潜能的干细胞,主要存在于结缔组织和器官间质中,无论在正常组织的稳态维持,还是损伤组织的修复中都发挥极为重要的作用。代谢性疾病所导致机体病理生理状态的改变会影响MSCs的功能,而MSCs功能受损反之会影响组织器官损伤的修复。此外,大量研究证实趋化因子及其受体不仅参与糖脂代谢的调节,还可以直接影响MSCs的功能,在MSCs参与组织修复时扮演重要角色。探讨代谢性疾病进展过程中趋化因子对MSCs的作用及机制,可以加深我们对代谢性疾病的认识。阿司匹林可以改善机体的炎症环境,因此明确炎症环境的改善对MSCs生物学特性的影响,将为深入了解代谢性疾病的发病机理提供新思路,为临床诊疗工作提供新的理论依据。研究目的：1.明确高热量摄入对大鼠骨髓来源MSCs (BMSCs)生物学特性的影响2.探讨趋化因子CINC-3对BMSCs生物学特性的影响及其调控机制3.明确阿司匹林对高热量摄入诱导的炎症环境的改善及BMSCs生物学特性的作用研究方法：1.不同饮食模式喂养的Sprague Dawley (SD)大鼠模型的建立与鉴定6周龄的SD大鼠随机分为三组,正常饮食组(Normal Diet, ND)大鼠饲喂基础饲料,高热量饮食组(High Fat Diet, HFD)大鼠饲喂定制的高热量饲料(基础饲料60%,添加10%蔗糖、20%猪油、10%蛋黄粉),重建饮食组(2GC)大鼠首先饲喂高热量饲料2个月后,改喂基础饲料,在喂养的不同时间点监测大鼠体重、体长及血清总胆固醇、空腹血糖、胰岛素耐量等生理生化指标,同时切取大鼠肝脏、脂肪及骨组织进行组织病理学观察。2.高热量摄入对大鼠BMSCs生物学特性的影响采用全骨髓贴壁培养法获取大鼠BMSCs,倒置显微镜下观察不同饮食模式喂养的大鼠BMSCs的细胞形态；通过MTS法检测各组细胞的增殖能力并通过Muse细胞状态分析仪对各组细胞的周期及凋亡水平进行检测；利用transwell法检测BMSCs的迁移能力；选用P3代大鼠BMSCs,分别向成脂成骨方向进行诱导分化,通过组化染色及Real-time PCR检测成脂成骨分化标志基因的表达,明确高热量摄入对BMSCs定向分化能力的影响；通过SA-β-Gal染色对不同饮食模式喂养的各组大鼠BMSCs老化程度进行评价,利用MitoSOXTM荧光染色检测活细胞线粒体超氧化物含量,流式分析法检测BMSCs过氧亚硝酸盐含量,并利用Real-time PCR检测BMSCs端粒酶逆转录酶TERT、组蛋白去乙酰化酶SIRT1的表达水平,探讨高热量摄入导致BMSCs老化程度增加的机制。3.高热量摄入诱导的趋化因子CINC-3对BMSCs生物学特性的作用不同饮食模式饲喂6个月大鼠,空腹12小时后,大鼠尾静脉取血并分离血清,采用细胞因子抗体芯片RayBio(?) Rat Cytokine Antibody Array G-Series 2检测大鼠血清中相关细胞因子含量,分析高热量摄入对大鼠血清细胞因子的影响。为探讨高热量摄入诱导的CINC-3对BMSCs生物学特性的作用,在BMSCs体外培养基中添加CINC-3,研究方法同前,检测BMSCs的增殖能力、细胞周期及凋亡、迁移能力、并对其老化及机制进行探讨。在体外诱导培养基中添加CINC-3,不同时间点通过组化染色及Real-time PCR检测成脂成骨分化标志基因的表达,明确高热量摄入诱导的CINC-3的增加对BMSCs定向分化能力的影响。4.高热量摄入诱导的趋化因子CINC-3对BMSCs迁移及分化能力的作用机制BMSCs体外培养过程中加入不同浓度的CINC-3进行刺激,通过Western Blot和G-LISA的方法检测相关蛋白ELMO1及Active Rac1的表达；并通过功能性封闭抗体Anti-CINC-3 antibody进一步验证高热量摄入诱导的CINC-3对ELMO1及Active Rac1的活化；通过MTS法检测Active Rac1的抑制剂 NSC23766对BMSCs增殖能力的影响,并利用组化染色和Real-time PCR检测成脂分化标志基因的表达,明确CINC-3抑制BMSCs成脂分化的作用机制；最后通过siRNA敲减实验,敲低BMSCs中ELMO1的表达,探讨CINC-3影响BMSCs迁移能力的作用机制。5.阿司匹林对改善高热量摄入诱导的炎症环境及BMSCs生物学特性的作用研究6周龄的SD大鼠随机分为四组：ND组大鼠饲喂基础饲料,HFD组大鼠饲喂定制的高热量饲料；2GC组大鼠首先饲喂高热量饲料2个月后,改喂基础饲料；重建饮食合并阿司匹林治疗组(2GC+Aspirin)在饲喂高热量饲料2个月后,改喂基础饲料的同时添加阿司匹林进行抗炎治疗。在喂养的不同时间点监测大鼠生理生化指标,并切取大鼠部分组织器官进行组织病理学观察。采用蛋白质芯片检测上述四组大鼠饲喂6个月血清中细胞因子水平的变化；并对各组大鼠BMSCs的生物学特性进行检测,研究方法同前,探讨阿司匹林对高热量摄入诱导的炎症环境的改善及对BMSCs生物学特性的影响。研究结果：1.不同饮食模式喂养的SD大鼠模型的建立与鉴定HFD组大鼠随喂养时间的延长,体型增大,体重和Lee’s指数增加,血清总胆固醇、空腹血糖含量升高,且组织胰岛素敏感性降低；2GC组大鼠在改变饮食后,血清总胆固醇迅速恢复正常,胰岛素耐量在改变饮食后4个月(2G4C)恢复正常。HFD组大鼠喂养6个月(6MG)肝脏、脂肪及骨组织存在明显的病理学改变,肝脏组织表现明显的脂肪变现象,腹腔大网膜处的脂肪组织细胞横截面直径增加,骨组织中破骨细胞数目增多；重建饮食组(2G4C)大鼠的组织器官病理学与正常饮食组(6MC)无明显差异。2.高热量摄入对大鼠BMSCs生物学特性的影响与6MC组BMSCs相比,6MG组大鼠BMSCs体外增殖能力降低,G0/G1期细胞比例增加,凋亡无明显变化；2G4C组大鼠BMSCs增殖能力、细胞周期及凋亡水平无明显差异。而6MG组和2G4C组大鼠BMSCs体外迁移能力增加,成脂、成骨分化能力降低；BMSCs老化现象明显,线粒体中超氧化物、过氧亚硝酸盐含量增加,端粒酶催化亚基TERT、组蛋白去乙酰化酶SIRT1表达水平降低。3.高热量摄入诱导的趋化因子CINC-3对BMSCs生物学特性的作用细胞因子蛋白质芯片检测结果显示,6MG组大鼠血清中趋化因子CINC-3、 CX3CL1、 LIX的水平比6MC组高出20%以上；2G4C组大鼠血清中CINC-3, LIX仍旧高于6MC组。ELISA结果进一步证实,2G4C组大鼠血清中CINC-3含量高于6MC组,且差异具有统计学意义。体外添加CINC-3对BMSCs的增殖无显著作用,但可促进BMSCs的迁移和老化,并下调BMSCs成脂分化相关基因Cebpa和PPAR-y的表达,抑制BMSCs成脂分化。4.高热量摄入诱导的趋化因子CINC-3对BMSCs迁移及分化能力的作用机制体外添加CINC-3, BMSCs中趋化因子信号转导通路相关蛋白ELMO1及Active Rac1的表达增加,Anti-CINC-3中和抗体可特异性抑制CINC-3诱导的BMSCs中ELMO1和Active Rac1的活化；体外添加Active Rac1的抑制剂NSC23766不影响BMSCs的增殖,但可在一定程度上逆转Active Rac1的激活对BMSCs成脂分化的抑制；敲减ELMO1后BMSCs迁移能力降低。5.阿司匹林对改善高热量摄入诱导的炎症环境及BMSCs生物学特性的作用研究2GC+Aspirin组大鼠的体重、Lee’s指数及空腹血糖一直维持在较稳定水平,其血清中总胆固醇在改喂正常饮食并抗炎治疗后1个月恢复正常；胰岛素耐量在改喂正常饮食并抗炎治疗后3个月恢复正常；2G4C+Aspirin组大鼠血清中绝大部分细胞因子恢复正常,CICN-3、 IL-lα水平仍高于6MC组；2G4C+Aspirin组大鼠BMSCs成脂分化能力及老化程度虽未恢复正常,但较2G4C组有所改善。研究结论：1.本研究构建了高热量饮食及重建饮食SD大鼠动物模型,发现大鼠重建饮食4个月(2G4C)后生理生化指标恢复正常,但其BMSCs与正常饮食组(6MC) BMSCs相比,老化现象仍然明显,迁移能力增加,成脂、成骨定向分化能力降低。同时,蛋白质芯片及ELISA对大鼠血清中细胞因子的检测发现,2G4C组大鼠趋化因子CINC-3水平亦未恢复正常,提示高热量摄入诱导大鼠血清CICN-3的升高可能与BMSCs生物学特性的变化有关。2.体外添加CINC-3对BMSCs的增殖无显著作用,但可促进BMSCs的迁移和老化,并抑制BMSCs成脂分化。进一步证实CINC-3与BMSCs生物学特性的相关性。3.体外添加CINC-3可促进Chemokine信号通路中ELMO1及Active Rac1的活化,而Anti-CINC-3中和抗体抑制其激活；敲减ELMO1降低BMSCs的迁移能力；体外添加Active Rac1的抑制剂NSC23766可在一定程度逆转Active Rac1的激活对BMSCs成脂分化的抑制。说明Chemokine信号通路中ELMO1和Active Rac1参与调控BMSCs的迁移及分化。4.重建饮食同时添加阿司匹林治疗组(2G4C+Aspirin)大鼠血清中绝大多数细胞因子均可恢复到正常水平,虽然趋化因子CINC-3未完全恢复正常,但其BMSCs老化程度及成脂分化能力均较2G4C组有所改善,说明阿司匹林可在一定程度上改善高热量摄入诱导的炎症环境及其对BMSCs生物学特性的影响。