前言胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,长期以来我国一直是胃癌高发区,因此胃癌的治疗研究仍是我国医务人员工作、研究的重点。迄今关于胃癌发病机制及治疗研究仍没有重大突破,尚不能满足临床对胃癌进行有效控制的需要。在正常情况下,胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡间保持动态平衡,这是其结构完整和功能健全的基础。这种平衡有赖于癌基因、抑癌基因,以及某些调节肽等的调控,一旦失控,癌基因被激活而抑癌基因被抑制,促使增殖加快,DNA损伤增加但得不到修复,产生非整倍体,而凋亡机制不能相应启动,使细胞获永生,渐进性细胞周期调控机制的破坏则最终进展到癌。因此,深入研究细胞周期的信号调控机制具有重要意义。细胞信号转导是外界环境刺激因子和胞间通讯信号分子等作用于细胞表面(或胞内)受体后,跨膜转换形成胞内第二信使,以及经过其后的信号途径级联传递、引起细胞生理反应和诱导基因表达的过程。细胞信号转导包括直接信号转导(细胞间的缝隙连接)和间接信号转导(跨膜信号转导)。细胞内的信号传递主要是通过JAK-STAT途径来实现信号转导的。信号传导转录活化因子(single transductors and activators of transcription, STATs)是一类脱氧核糖核酸(DNA)结合蛋白,哺乳动物中STAT家族成员包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6。非受体性蛋白酪氨酸激酶超家族中的Jauns激酶家族JAK及信号传导转录活化蛋白家族STATs是细胞对IL等细胞因子反应的一些基本蛋白分子,构成细胞因子信号传导的经典途径,称JAK/STAT途径。近年研究发现STAT3广泛表达于不同类型的细胞和组织中,参与细胞生长、凋亡、恶变等生理功能的调控。细胞因子激活Jauns激酶家族的酪氨酸激酶(Jauns激酶),后者磷酸化并激活STAT蛋白,激活前的STAT蛋白属于胞浆蛋白,而活化后的STAT则以同源或异源二聚体形式移位到胞浆,在靶基因的启动区与特定的DNA元件结合,发挥其生物学活性。亦有实验表明,细胞内的刺激可以激活STAT,已有大量实验证实STAT与中枢神经系统疾病、肿瘤、心血管系统疾病等多种病理生理过程有着密切的关系。多数取自人类的癌标本和源于肿瘤的细胞株中都有组成性活化的STAT蛋白,其中以STAT3最为常见。研究发现STAT3的异常活化可以促进细胞的分化增殖,抑制细胞的凋亡,有利于肿瘤细胞的发生发展及耐药细胞株的出现。Survivin是凋亡抑制因子IAPs家族(Inhibitors of apoptosis)的新成员,被认为在bcl-2的下游阻断了半胱氨酸蛋白酶Caspase-3和Caspase-7凋亡调节通路,具有抑制细胞凋亡促进细胞增殖的作用。有研究表明Survivin可能是STAT3信号通路的一个下游靶基因。目的本研究采用免疫组织化学技术检测是STAT3、p-STAT3和Survivin在正常胃黏膜、肠化生、异型增生和胃癌组织中的表达,分析三者基因编码蛋白在胃癌发生、发展过程中的作用和三者在胃癌中表达的相关性,以及STAT3、p-STAT3和Survivin与胃癌临床病理因素之间的关系,并探讨相关的分子病理学机制。材料与方法临床资料：收集中国医科大学附属第一医院手术切除并经病理学检查证实的胃癌标本及其配对正常胃黏膜各91例,肠上皮化生35例,异型增生7例。91例胃癌患者中男56例,女35例；年龄26～81岁,中位年龄60岁；胃癌大体Borrmann分型：Ⅱ型6例,Ⅲ型78例,Ⅳ型7例；WHO病理组织学分型：乳头状腺癌2例,高分化管状腺癌8例,中分化管状腺癌27例,低分化腺癌32例,黏液腺癌14例,印戒细胞癌4例,未分化癌4例。所有标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,制成4μm厚切片备用。所有患者术前均未接受放、化疗。胃癌组织芯片制作：采用组织芯片制作仪(Microarrayer,Beecher Instruments,USA)制作组织芯片。构建完成胃癌及其癌前病变的组织微阵列石蜡块1、2、3和4(蜡块1：含115个组织芯；蜡块2：含107个组织芯；蜡块3：含108个组织芯；蜡块4：含121个组织芯)。将组织芯片蜡块行连续切片,切片厚度为4μm,用于免疫组织化学染色的切片裱于经0.1%多聚赖氨酸防脱片处理的载玻片上,60℃烤片1小时,58℃中继续烤片18小时,常温保存备用。免疫组化染色检测STAT3. p-STAT3和Survivin蛋白表达：采用PV-9000方法对胃癌及其癌前病变组织芯片进行免疫组化染色。兔抗人STAT3单克隆抗体(工作浓度1：120)和p-STAT3单克隆抗体(工作浓度1：30)分别为美国CST和SAB公司产品；兔抗人Survivin多克隆抗体购自福州迈新公司。PV-9000通用型二步法免疫组化检测试剂盒和DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥生物有限公司。所有操作步骤依据产品说明书进行,每组试验均以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：免疫组化染色以细胞浆和／或细胞核中出现清晰棕黄色颗粒为阳性细胞。每一病例随机选择2个高倍镜视野,计数200个细胞,阳性细胞占计数同类细胞百分率≤5%为0分,6%～25%为1分,26%～50%为2分,51%～75%为3分,≥76%为4分。染色强度以阳性细胞呈色反应为准：无特异着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分；然后按染色强度和阳性细胞所占的百分比的乘积将结果分为：0分为阴性(-)；1～4分为弱阳性(+)；5～8分为中度阳性(++),9～12分为强阳性(+++)。统计学分析：采用SPSS 11.5统计学软件处理,STAT3、p-STAT3及Survivin蛋白在正常胃黏膜和胃癌及其癌前病变中的表达阳性率的比较应用χ2检验和Fisher确切概率法,STAT3、p-STAT3及Survivin三者的表达相关性评价应用Kendall’s tau-b等级相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果STAT3蛋白阳性信号主要分布在细胞浆。STAT3蛋白在肠化生(95.2%,20／21)、异型增生(85.7%,6／7)和胃癌组织中(67.0%,60／91)的阳性表达率显著高于正常胃黏膜(6.6%,85／91),P<0.001。异型增生和胃癌组织中STAT3的表达阳性率之间差异无统计学意义,P=0.738。胃癌组中STAT3表达阳性率显著低于肠上皮化生组(χ2=10.91,P=0.012)。p-STAT3蛋白阳性信号主要分布在细胞核,部分在细胞浆表达。p-STAT3蛋白在肠化生(71.4%,15／21)、异型增生(100%,5／5)和胃癌组织中(60.0%,30／50)的阳性表达率显著高于正常胃黏膜(32%,16／50),P<0.05。肠上皮化生、异型增生组织与胃癌组织中p-STAT3的表达阳性率之间差异无统计学意义(P=0.710；P=0.050)。胃癌组织中STAT3及p-STAT3蛋白表达均与患者年龄、性别、胃癌Borrmann分型、组织学类型、Lauren分型及侵袭深度无关,P>0.05,但两者表达与胃癌淋巴结转移密切相关,即有淋巴结转移组STAT3和p-STAT3阳性表达率显著高于无淋巴结转移组,P<0.05。在胃癌组织中STAT3与p-STAT3蛋白表达呈正相关,有统计学意义(rk=0.288,P=0.013)。Survivin蛋白阳性信号主要分布在细胞浆,Survivin在肠上皮化生(32／35,91.4%)、异型增生(4／4,100%)和胃癌(74／91,81.3%)组织中的阳性表达率显著高于远癌正常胃黏膜(2／51,3.9%),P<0.001。肠上皮化生组Survivin阳性表达率显著高于胃癌组(χ2=12.694,P=0.005),而异型增生组织与胃癌组织中Survivin表达阳性率之间未见统计学差异,P=0.118。胃癌组织中Survivin蛋白表达与患者年龄、性别、胃癌Borrmann分型、组织学类型、Lauren分型及侵袭深度无关,P>0.05,但与胃癌淋巴结转移密切相关,即有淋巴结转移组Survivin阳性表达率显著高于无淋巴结转移组,P<0.05。胃癌组织中p-STAT3蛋白表达与Survivin蛋白表达未见相关(rk=0.081,P=0.537)。结论1、STAT3在细胞中的过度激活在胃癌的发生发展、侵袭转移的过程中起着重要的作用。p-STAT3作为STAT3的活化形式,与代表胃癌恶性生物学本质的淋巴结转移密切相关。本研究结果提示STAT3和p-STAT3蛋白可以作为胃癌诊断和预后判断的分子标志物,对其进行深入研究有望为胃癌的诊断与治疗提供新的思路。2、Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员,是联系细胞周期和细胞凋亡的重要因子。本研究表明Survivin参与了胃黏膜癌变过程,Survivin有望作为一个有临床应用价值的胃癌早诊和胃黏膜癌变预警的蛋白标志物。本研究结果提示Survivin也有望成为临床判断胃癌预后不良的指标。