【摘 要】
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目的:研究LASS2对甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）细胞BCPAP自噬活性和上皮间质转化（Epithelical-mesenchymal transition,EMT）的影响,并通过组织标本检测验证PTCs癌组织、癌旁正常组织中LASS2、SQSTM1/p62的表达情况及与患者临床病理学特征的相关性。方法:1.Adv-LASS2-GFP重组腺病毒感
【基金项目】
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遵义市科学技术局(遵市科合 HZ 字（2019）68 号；
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目的:研究LASS2对甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）细胞BCPAP自噬活性和上皮间质转化（Epithelical-mesenchymal transition,EMT）的影响,并通过组织标本检测验证PTCs癌组织、癌旁正常组织中LASS2、SQSTM1/p62的表达情况及与患者临床病理学特征的相关性。方法:1.Adv-LASS2-GFP重组腺病毒感染BCPAP细胞构建LASS2过表达的细胞模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR）、蛋白印迹（Western blotting,WB）实验验证LASS2过表达的BCPAP细胞模型构建成功。2.转染48小时后通过透射电镜观察各组细胞自噬相关结构,q RT-PCR、WB检测自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3A/B、Beclin-1在各组细胞中的表达情况。3.通过划痕实验和Transwell小室实验检测各组细胞侵袭、迁移能力,WB检测EMT相关蛋白MMP2、MMP9、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达情况。4.co-IP/LC-MS筛选与鉴定LASS2互作蛋白,经GO pathway、STRING等软件进行生信分析并构建互作网络图,并经co-IP WB进一步验证互作关系。5.免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）实验检测PTC组织标本中LASS2、SQSTM1/p62的表达差异及其与侵袭转移特征的相关性。结果:1.成功构建过表达LASS2基因的甲状腺乳头状癌BCPAP细胞模型,q RT-PCR、WB实验结果显示:过表达LASS2明显提高实验组（Adv-LASS2-GFP组）LASS2 m RNA及蛋白相对表达量（P＜0.001）。2.转染48小时后,透射电镜观察到Adv-LASS2-GFP组较Adv-GFP组细胞中多的自噬溶酶体和自噬小体;q RT-PCR、WB实验结果显示:过表达LASS2明显促进Beclin-1、LC3B m RNA及蛋白水平相对表达（P＜0.05）,过表达LASS2不影响SQSTM-1/p62的m RNA表达水平（P＞0.05）;WB实验结果示:过表达LASS2明显下调BCPAP细胞SQSTM-1/p62蛋白相对表达水平（P＜0.001）。3.划痕实验、Transwell实验结果表明:过表达LASS2明显抑制BCPAP细胞侵袭、迁移能力（P＜0.01）,并在蛋白水平改变EMT进程相关蛋白的表达（P＜0.001）。4.经co-IP/LC-MS分离LASS2互作蛋白,并行GO pathway、STRING等软件行生信分析,筛选与LASS2互作的自噬关键蛋白并构建蛋白-蛋白互作网络图,结果提示LASS2与p62/CSNK2A1/HSP90/HSP70可能存在直接或间接互作关系。进一步co-IP WB分析结果示LASS2与p62不存在直接结合,提示两者可能通过其他中间蛋白参与互作。5.IHC实验分析LASS2、SQSTM1/p62蛋白在30对PTC组织标本中的相对表达,结果表明:LASS2在癌组织中的表达水平较癌旁正常组织低,并与淋巴结转移有关（P＜0.01）;p62在癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.01）;p62的表达情况与肿瘤突破包膜和淋巴结转移相关（P＜0.01）。结论:1.LASS2可能通过与p62/CSNK2A1/HSP90/HSP70互作激活自噬抑BCPAP细胞侵袭;2.LASS2、p62在PTC组织和癌旁正常组织中存在表达差异,并与淋巴结转移相关。
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