论文部分内容阅读
研究背景太赫兹(terahertz,THz)波是指频率在0.1—10THz(1THz=1012Hz)范围的电磁波。由于生物大分子内和分子间的弱相互作用力和骨架振动和偶极子旋转等能级正好处于THz频谱范围内,奠定了太赫兹光谱技术在核酸、蛋白质、糖类等生物大分子上应用的基础。但是,目前THz光谱技术应用主要集中在样品是固态或是干燥状态下的单一种类分子的检测与分析,无法对含有多种生物大分子且处于液相状态下的临床生物样本的实际检测,其原因在于溶液中水分子对THz波的强烈吸收掩盖了生物大分子的特征峰。研究目的本课题拟利用课题前期核酸扩增结果基础上,利用现有的太赫兹时域光谱系统(THz time-domain spectroscopy,THz—TDS)检测液相条件下的核酸来初步探索性研究THz波的水敏感性;利用金属开口谐振环结构的超材料在干燥状态下检测恒温指数扩增反应(Isothermal exponential amplification reaction,EXPAR)前后反应体系初步探讨太赫兹波段超材料应用的优缺点。研究方法1.利用NCBI网站查找目的基因序列,设计合成四对常规聚合酶链反应(PCR)的引物;查阅文献设计恒温指数扩增反应的引物和模板,对引物、模板和EXPAR反应温度等反应条件进行优化去增加目的DNA片段的产率,对模板序列的寡核苷酸进行硫代修饰去抑制EXPAR空白对照(NTC)的较早出现非特异扩增的现象。2.使用THz-TDS在液相条件下检测PCR扩增后纯化的DNA片段,获得四种片段DNA水溶液和去离子水的时域谱和频域谱;构建样本厚度120μm的检测池来减弱水敏感度问题。3.设计并制作一种金属开口谐振环阵列的超材料来提高THz波检测灵敏度,在充满氮气干燥环境下使用THz-TDS系统检测干燥的核酸以及EXPAR扩增前后反应体系。研究结果1.常规PCR的反应结果良好,无需进一步对反应条件进行优化探索;恒温指数扩增反应的最佳反应温度为57.6℃,通过对模板序列的硫代修饰明显减弱了NTC的非特异扩增,同时也导致了它的引物需要量提高了 104倍以上。2.设计的四对上下游引物成功扩增出145bp、202bp、281bp、357bp四种不同长度的DNA片段。THz—TDS系统在液相条件下未能检测出它们的特征吸收峰,但同一摩尔浓度下它们的吸收强度各有差异且四种不同片段DNA与水吸收系数差值呈单调变化,357bp的DNA片段的吸收系数最小。3.在金属开口谐振环结构的超材料上,145bp长度的DNA片段的灵敏度为118.3ng/GHz;EXPAR扩增前反应体系的频率偏移量△f1=(54±3)GHz、扩增后反应体系频率偏移量△f2=(60±5)GHz。研究结论1.设计的检测池在THz-TDS下检测并区分了不同片段长度的DNA,THz-TDS技术有望成为临床上一种新的定量检测手段。2.文中通过对EXPAR模板序列的硫代寡核苷酸的修饰有效的解决了NTC出现扩增现象,EXPAR这一高效率和温度均一性的核酸扩增技术将会得到更多的应用。3.太赫兹波段的超材料对微量生物大分子具有很高的灵敏度,缺乏分辨生物大分子的特异性。