论文部分内容阅读
甲萘醌-7(MK-7)属于维生素K2的一种，在血液凝固及预防骨质疏松和心血管钙化方面起着重要作用。与化学合成法相比，微生物发酵法生产MK-7具有质量可控、安全、绿色、天然等优点，而构建基因工程菌作为生产菌株，比诱变育种更具优势。本文以枯草芽孢杆菌168(Bacillus subtilis 168)为出发菌，将B.subtilis内MK-7的生物合成途径分为四个模块：MK-7途径、莽草酸(SA)途径、甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径、甘油异化途径。
原位替换MK-7途径中menFDHBEC操纵子的启动子及过表达异源基因menI，对MK-7的合成没有明显影响，而过表达menA使得MK-7产量提高109%。原位替换hepS-menG-hepT操纵子的启动子可促进MK-7的合成，但是原位替换已过表达menA的菌株中该操纵子的启动子，则导致MK-7产量略有降低。
过表达SA途径的aroA、aroD、aroE，导致MK-7产量不同程度地降低，而过表达aroK，对合成MK-7的促进作用不明显。过表达MEP途径的dxs、dxr、yacM、yacN，均可促进MK-7的合成，同时过表达这四个基因使得MK-7产量增加83%；而过表达MEP途径的ispE、yqfP、yqiD，均导致MK-7产量降低。
敲除ldh和pabB-pabA，对MK-7的合成没有明显影响；敲除alsS-alsD和aroH，导致MK-7产量大幅降低。然而敲除dhbB，切断肠菌素的合成，使得MK-7产量增加11%。另外，过表达甘油经异化途径的glpK和glpD，并敲除mgsA和araM，分别切断丙酮醛和甘油-1磷酸的合成，使得MK-7产量增加22%。
此外，过表达异源基因aroGfbr及内源基因pyrGfbr，MK-7产量均略有增加，然而过表达七烯焦磷酸合成酶组分I—HepS，使得MK-7产量增加11.6%。敲除bd氧化酶编码基因cydAB，对MK-7合成没有明显影响，而过表达透明颤菌血红蛋白VHb，MK-7产量略有增加。最终构建得到菌株BSMK11，摇瓶发酵的MK-7产量为58.95±1.20mg/L，较出发菌提高5.4倍。在5L罐中进行分批补料发酵，132h后MK-7产量达到最高，为281.4±5.0mg/L(12.0 mg/g DCW)，高于之前报道的B.subilisnatto生产MK-7的最高产量。本研究对B.subtilis内MK-7的从头合成途径进行了比较全面的工程改造，遗传背景清晰，能够克服突变菌株的缺陷，具有重要的科学意义及应用价值。
原位替换MK-7途径中menFDHBEC操纵子的启动子及过表达异源基因menI，对MK-7的合成没有明显影响，而过表达menA使得MK-7产量提高109%。原位替换hepS-menG-hepT操纵子的启动子可促进MK-7的合成，但是原位替换已过表达menA的菌株中该操纵子的启动子，则导致MK-7产量略有降低。
过表达SA途径的aroA、aroD、aroE，导致MK-7产量不同程度地降低，而过表达aroK，对合成MK-7的促进作用不明显。过表达MEP途径的dxs、dxr、yacM、yacN，均可促进MK-7的合成，同时过表达这四个基因使得MK-7产量增加83%；而过表达MEP途径的ispE、yqfP、yqiD，均导致MK-7产量降低。
敲除ldh和pabB-pabA，对MK-7的合成没有明显影响；敲除alsS-alsD和aroH，导致MK-7产量大幅降低。然而敲除dhbB，切断肠菌素的合成，使得MK-7产量增加11%。另外，过表达甘油经异化途径的glpK和glpD，并敲除mgsA和araM，分别切断丙酮醛和甘油-1磷酸的合成，使得MK-7产量增加22%。
此外，过表达异源基因aroGfbr及内源基因pyrGfbr，MK-7产量均略有增加，然而过表达七烯焦磷酸合成酶组分I—HepS，使得MK-7产量增加11.6%。敲除bd氧化酶编码基因cydAB，对MK-7合成没有明显影响，而过表达透明颤菌血红蛋白VHb，MK-7产量略有增加。最终构建得到菌株BSMK11，摇瓶发酵的MK-7产量为58.95±1.20mg/L，较出发菌提高5.4倍。在5L罐中进行分批补料发酵，132h后MK-7产量达到最高，为281.4±5.0mg/L(12.0 mg/g DCW)，高于之前报道的B.subilisnatto生产MK-7的最高产量。本研究对B.subtilis内MK-7的从头合成途径进行了比较全面的工程改造，遗传背景清晰，能够克服突变菌株的缺陷，具有重要的科学意义及应用价值。