全内反射荧光显微术是一种基于倏逝波照明的荧光显微成像技术。全内反射荧光显微术利用了全内反射产生的倏逝波进行照明,其倏逝场的激发深度为纳米级,在激发薄层范围内的荧光样品得到激发。显微术具有成像质量高、图片信噪比高等优点,因此被广泛应用于单分子成像、胞吞胞吐以及细胞间信号传递等生物成像领域,成为荧光显微术的重要分支。但是,随着对显微术成像质量需求的不断提高和细胞三维空间结构的获取,传统的全内反射荧光显微术无法满足其成像的需求,课题“基于椭球反射镜全内反射荧光显微成像方法与理论研究”的目的是寻求可兼顾多方向均匀照明和激发深度大量程可控可调,为解决全内反射荧光成像广泛存在的伪影问题和扩大激发深度的照明范围提供了理论和方法。研究成果可进一步设计成模块化装置,与宽场显微术、结构光显微术和暗场显微术结合,方便地实现功能复用。本课题主要研究工作如下:首先,建立椭球反射镜的几何聚焦模型和孔径角为?的切趾因子函数,分析基于德拜矢量衍射理论的不同偏振光照明下的矢量聚焦特性。理论分析表明,在去偏振的作用下,出现了两个电场分量,在强度近似、方向垂直的两个电场分量的作用下,总电场的能量密度在椭球反射镜近焦点处的焦平面出现了横向扁状单峰光斑。其次,实现基于全内反射的基本理论和基于德拜矢量衍射理论的椭球反射镜聚焦特性的结合,分别在基于物镜的和基于椭球反射镜的全内反射荧光成像下,系统地分析不同偏振光下不同结构的显微术中倏逝波光场分布的差异。通过仿真对比,证明了基于椭球反射镜的方法具有更好的照明和更大范围的激发深度。第三,开展基于椭球反射镜的全内反射荧光成像方法研究,通过对全内反射的入射角的研究,给出了椭球反射镜的制造加工参数,并根据椭球反射镜设计出伪影弱化模块和三种可控激发深度模块,搭建基于椭球反射镜的全内反射荧光成像光路;此外,从工程化模块化的角度设计并研制了成像模块。最后,对基于椭球反射镜的全内反射荧光显微术下的样品进行实验验证。在微球样品的实验下,样品的光照分布均匀,照明的单向性带来的伪影效应得到了明显的抑制;在生物样品的实验下,本方法具有很高的信噪比和更多的样品细节;在可控激发深度的实验下,不同的荧光微球直径间接证明了本方法可以实现大范围下的激发深度可调功能。