论文部分内容阅读
目的证实人脐静脉内皮细胞是否有细胞信号转导抑制因子-1(SOCS1)表达;证实RNA干扰是否能有效抑制SOCS1在内皮细胞中的表达;探讨沉默SOCS1的表达对内皮细胞缺氧复氧损伤的影响。方法1.培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC),利用RT-PCR检测SOCS1在HUVEC中的表达。2.设计并化学合成4对靶向SOCS1的siRNA:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4。3.将带有荧光标记的阴性对照siRNA配制成25、50、75、100 nmol/L的4组,利用脂质体转染内皮细胞,并在倒置荧光显微镜下观察转染效率,得出有最佳转染效率的浓度。4. HUVEC根据不同的处理因素分成8组:siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3、siRNA-4和阳性对照组、阴性对照组、转染试剂组、空白对照组4个对照组。将均为有最佳转染效率浓度的各组siRNA转染细胞,48小时后提取RNA进行RT-PCR。筛选出1对对SOCS1沉默效率最高的siRNA。5.将筛选出来的最有效siRNA和阴性对照siRNA以有最佳转染效率的浓度转染内皮细胞,转染24小时后分为4组:①阴性对照siRNA;②阴性对照siRNA +缺氧20小时/复氧4小时;③SOCS1 siRNA;④SOCS1 siRNA+缺氧20小时/复氧4小时。Western Blot检测细胞Caspase-3、Bax蛋白的表达。结果1.未经任何干扰因素培养的人脐静脉内皮细胞能高表达SOCS1。2. siRNA在50nmol/L时有较高的转染效率。3. 4对siRNA干扰后,SOCS1 mRNA的表达水平与阴性对照组、转染试剂组和空白对照组相比明显下调(P<0.05),与阳性对照组相比显著下调(P<0.01),其中siRNA-3的沉默效率最高(P<0.05),阴性对照组、转染试剂组和空白对照组与阳性对照组相比明显下调(P<0.05),阴性对照组、转染试剂组和空白对照组之间差别无统计学意义(P>0.05)。4.对HUVEC进行RNA干扰和缺氧复氧处理后,SOCS1 siRNA+缺氧复氧组的Caspase-3、Bax蛋白表达水平与阴性对照siRNA组、阴性对照siRNA+缺氧复氧组和SOCS1 siRNA组相比明显升高(P<0.05),阴性对照siRNA+缺氧复氧组的Caspase-3、Bax蛋白表达水平与阴性对照siRNA组相比明显升高(P<0.05),阴性对照siRNA +缺氧复氧组的Caspase-3蛋白表达水平与SOCS1 siRNA组相比明显升高(P<0.05),而阴性对照siRNA组与SOCS1 siRNA组之间的Caspase-3蛋白表达水平差别无统计学意义(P>0.05),SOCS1 siRNA组的Bax蛋白表达水平与阴性对照siRNA组相比明显升高(P<0.05)。结论1.本研究首次发现未经任何干扰因素培养的人脐静脉内皮细胞能高表达SOCS1。2. RNA干扰能有效抑制SOCS1在内皮细胞中的表达。3.沉默SOCS1表达可加剧缺氧复氧导致的内皮细胞凋亡。