第一部分CRABP2的表达调控和TOB1的特征分析维生素A是人体生长发育及维持机体生命活动所不可或缺的一种微量营养素,它除了在细胞分化方面具有明确的作用以外,同时还参与如精子生成、免疫反应、视觉、味觉、听觉、食欲和生长等许多其他生理生化过程。它包括视黄醇、视黄醛、视黄酸三种物质形式。其中,其活性代谢物视黄酸调节细胞分化和增殖等许多生理生化过程,是通过调节许多目标基因的转录来实现的,但要充分发挥其功能必须和某些蛋白相结合,其中就包括CRABPs基因家族。TOB1基因是具有调节细胞增殖等多功能的TOB/BTG基因家族的一个重要成员,对它的研究可为进一步探索该基因的生物学功能、进一步了解猪肌肉发育以及中外猪种肉质性状差异的分子遗传基础积累一些素材。本实验室通过LongSAGE文库筛选出CRABPs基因家族和TOBl基因在猪胚胎发育不同时期的骨骼肌里呈现差异表达,因此推测它们可能对肌肉发育起调控作用,本研究就是通过初步的一些功能分析来进一步了解它们对肌肉发育所可能具有的调控作用。本实验利用RT-PCR和Real time PCR技术分别检测了CRABPs和TOB1基因在C2C12细胞以及C2C12分化时期的表达情况,发现它们的表达量均呈现上升趋势。随之我们构建了CRABP2基因和TOB1基因的过表达载体,分别转染C2C12细胞和PK15细胞,利用荧光显微镜对转染细胞的形态进行了观察,结果发现转染CRABP2的细胞形态呈现出分化的趋势,TOB1融合蛋白则在PK15的细胞核和细胞质里表达。对转染CRABP2过表达载体的C2C12细胞,采用流式细胞仪对其细胞周期进行分析,结果发现过表达组与空白对照组和阴性对照组相比,在G1期没有显著变化,但G2/M期细胞量减少,S期细胞量增加,这些都和C2C12细胞在分化早期所具有的一些特征相符合,推测CRABP2基因可能在肌纤维的分化过程中发挥了重要的作用,这为进一步研究该基因家族在猪肌肉发育中的作用奠定基础,并为其将来运用于标记辅助育种提供依据。本实验还从小鼠CRABP2基因的启动子出发,对该基因的表达调控机制做了初步的研究。采用PCR方法分离得到小鼠CRABP2基因的启动子序列,并将其连接到pGL3-basic载体中,转染C2C12细胞,检测发现这一启动子片段的荧光素酶活性显著升高,从而说明了这一启动子片段的功能性。利用启动子分析软件和数据库对CRABP2基因启动子中可能的转录因子进行预测,根据预测结果,设计引物构建各种不同长度的荧光素酶载体。通过转染检测,鉴定出其最小的功能性核心启动子区域,进一步分析发现该区域中存在两个可能的对该启动子活性影响较大的MyoD和Sp1转录因子结合位点。分别采用过表达和定点突变的方法,初步证实了MyoD和Sp1转录因子的调控作用,而CRABP2启动子中的MyoD和Sp1结合位点和MyoD和Sp1转录因子的结合通过凝胶阻滞电泳实验也进一步得到证实。第二部分猪TIM4基因特征及其与免疫性状的关联分析T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子4(TIM4),是T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(Tcell immunoglobulin domain and mucin domain)家族的一个重要成员,该家族在免疫应答中发挥着重要作用,同时它也参与了多种自身免疫性疾病的发生、发展过程,比如哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化症和非肥胖型糖尿病等。鉴于它在多方面的重要作用意义,本研究通过对猪TIM4基因进行特征和功能分析,旨在为它的生物学功能和猪的遗传育种等提供参考依据。人和小鼠的TIM4基因目前都已有研究,但猪TIM4基因还未见到相关报道。我们通过生物信息学搜索并分析,分别设计一系列引物进行PCR扩增,获得猪TIM4基因的mRNA序列、5’上游序列和其内含子序列,发现其与人TIM4基因存在较高的相似性,包含9个外显子和8个内含子。其阅读框有1086bp,编码361个氨基酸,分子量为39.9 kDa,等电点为6.75。Real-time PCR检测表明猪TIM4基因在肝脏、淋巴、脾脏中相对高表达；而在其他组织中表达量较低,这进一步说明了其在免疫系统中的重要生物学作用。我们还构建了绿色荧光表达载体,以进行亚细胞定位的研究,结果表明TIM4融合蛋白主要定位在PK15细胞的细胞质里。TIM4启动子的研究,表明猪和人TIM4基因的启动子区域有着80%的相似性,并且含有TATA box、GATA3、Oct1、CdxA等多处转录因子结合位点。同时我们鉴定出猪TIM4第3内含子上存在C/T突变位点,应用PCR产物直接测序技术,我们进行了基因型与免疫性状的关联分析,该数据表明,SNP 1533(C/T)基因型与中性粒细胞百分数(NEI%)(0 day)(p=0.0009),单核细胞百分数(MON%)(0 day) (p=0.0021和红细胞压积(HCT)(17 day) (p=0.0063)显著相关。