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A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）的M1蛋白在病毒的生命周期中发挥着重要的生物学作用,特别是M1在病毒的组装和出芽过程中严格依赖于宿主因素的相互作用。研究M1与宿主蛋白的相互作用,可能发现来源于宿主系统的可以调控流感病毒增殖的关键因子,还有助于进一步的阐明流感病毒感染和复制的潜在分子机制。本研究利用免疫沉淀联合质谱分析在鸡成纤维细胞系DF1中鉴定到19个疑似与M1（H5N6）相互作用的蛋白。筛选发现其中的26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基12（26S Proteasome Non-ATPase Regulatory Subunit 12,PSMD12）可以显著促进AIV（H5N6）在DF1细胞上增殖。机制上,发现了PSMD12与M1互作并促进M1K102位氨基酸发生K63-linked泛素化修饰,并且PSMD12促进H5N6增殖依赖于M1 K102位点。进一步结果表明H5N6病毒M1 K102位点的突变或者knockdown PSMD12抑制病毒的出芽释放。最终在体内实验中评价了M1 K102突变对JX（H5N6）和PR8（H1N1）对小鼠致病力的影响。主要内容如下:1.鉴定与M1相互作用的禽源宿主蛋白在19个潜在与M1互作的宿主蛋白中有15个被成功克隆至PCAGGS载体,采用过表达宿主蛋白的方式验证宿主蛋白对病毒的调控作用,由培养上清中的病毒产量来评价。结果表明,抑制两倍以上病毒空斑数的宿主基因5个,分别是CALM2、DNAJC10、HSP70、HSPA8和MYO1D,促进两倍以上病毒空斑数量的宿主基因有3个,分别是GAPDH、HIST1H2B5L和PSMD12。其中过表达PSMD12对AIV复制的促进作用最为显著。2.PSMD12调控禽流感病毒增殖上述结果表明PSMD12的过表达促进AIV在DF1细胞上的增殖,我们进一步使用si RNA knock-down DF1细胞中的PSMD12进行了反向验证了knock-down PSMD12抑制了AIV的增殖。进一步通过sh RNA knock-down人源宿主细胞中的PSMD12基因,验证了knock-down PSMD12抑制了AIV（H5N6）在人源A549细胞上的增殖。表明禽和人的宿主细胞中PSMD12有类似的调控流感病毒增殖的作用。3.PSMD12与M1的相互作用正向和反向Co-IP实验结果表明禽源以及人源的PSMD12与M1的相互作用,并且在AIV（H5N6）感染的禽源细胞DF1或人源细胞A549中证明了PSMD12与M1共定位,说明PSMD12与病毒感染过程中M1存在真实相互作用。4.PSMD12促进M1的泛素化修饰通过泛素化检测系统验证了M1能够被泛素化修饰,并且在PSMD12过表达的情况下M1的泛素化修饰增强。进一步对PSMD12介导的M1泛素化修饰进行分类,发现PSMD12促进M1发生泛素化修饰的类型为K63-linked。5.M1 K102位点对于PSMD12介导的K63-linked泛素化修饰非常重要利用BDM-PUB和UBPRED预测在M1蛋白上有9个赖氨酸位点可能发生泛素化修饰,并进一步通过试验进行逐一突变验证。发现PSMD12介导下M1的K102位点泛素化修饰重要,并且此位点在IAV中高度保守。6.PSMD12促进流感病毒增殖与M1 K102位点有关通过反向遗传构建了AIV（H5N6）以及PR8（H1N1）的M1 K102R突变体。在PSMD12过表达或者knockdown的DF1细胞中,H5N6-M1-K102突变病毒的增殖没有得到促进或抑制。表明PSMD12促进AIV（H5N6）增殖作用与M1 K102位点有关。7.M1 K102位点的突变抑制病毒体外增殖在不同细胞系上比较了H5N6-M1/PR8-M1与对应突变型毒株H5N6-M1-K102R/PR8-M1-K102R的增殖曲线,发现在M1 K102位点突变之后病毒的增殖能力下降。尽管在M1 K102位点突变之后上清中的病毒产量降低,但是感染细胞的内部的病毒蛋白升高。提示我们在AIV（H5N6）或者PR8（H1N1）的M1 K102位点突变之后,病毒的出芽（释放）可能受到了抑制。8.M1 K102位点的突变或knockdown PSMD12影响病毒出芽M1与M2共转染可以形成释放型的M1-M2 VLPs,当突变型的M1,即M1-K102R与M2共转染后形成M1-M2 VLPs的能力降低。进一步通过透射电子显微镜观察到H5N6-M1-K102R病毒的出芽受到了抑制。另外,在宿主方面,knock-down PSMD12同样抑制了H5N6病毒在CEF细胞上的出芽。9.M1 K102位点的突变影响了AIV（H5N6）和PR8（H1N1）对小鼠致病力通过小鼠的感染试验确定了H5N6-M1和PR8-M1的半数致死剂量MLD50,在调整了野生病毒和突变病毒的为相同感染剂量之后,评价感染后0-14天感染小鼠的体重变化,生存曲线,组织病理切片以及组织病毒载量。得出结论:M1 K102位点的突变显著降低了AIV（H5N6）和PR8（H1N1）对小鼠致病致死的能力。