论文部分内容阅读
目的大肠癌是一种常见恶性肿瘤,大肠癌病死率在西方国家位于恶性肿瘤死亡的第3位,仅次于肺癌和乳腺癌,在我国占恶性肿瘤死因的第5位,且发病率呈逐年升高趋势。早、中期大肠癌以手术治疗为主,晚期及术后复发患者,其主要治疗手段则为化疗。但是目前化疗疗效并不乐观,大肠癌化疗疗效显著降低的主要原因之一是由于肿瘤多药耐药性(multidrug resistance, MDR)的产生,尤其是大肠癌细胞的MDR原发性高表达及继发性高表达。MDR的特点是一旦对某种化疗药物产生耐药,则对结构、细胞作用靶点和作用机制均不同的抗癌药物都可产生交叉、广谱的耐药现象[1]。本研究通过比较短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰表达质粒与防粉己碱(Tetrandrine, Tet)对大肠癌LOVO/5-Fu细胞株MDRlmRNA的表达、P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达、对细胞周期和凋亡率的影响、以及对化疗药物敏感性的影响,探讨shRNA干扰质粒和Tet大肠癌LOVO/5-Fu耐药细胞株的耐药性的逆转作用,以期找到一种逆转策略能更好的逆转肿瘤细胞的MDR,以指导临床用药。方法靶向MDR1的shRNA干扰质粒和Tet分别作用于人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu,噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞对5-Fu的敏感性,流式细胞术检测细胞周期变化、凋亡情况及P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达,实时荧光定量PCR (Realtime-PCR)检测各组细胞MDR1 mRNA的表达水平,Western blot检测各组细胞P-gp的表达水平,并分析各组结果之间的差异。实验结果用SPSS 10.0统计软件分析。结果1、两种干扰因素作用后细胞对5-FU敏感性的变化：转染组[IC50=(2.38±0.45)mol/m1]比对照组[IC50=(7.27±0.34)mol/m1]的IC50显著降低(P<0.05),相对逆转率为72.7%；Tet作用组[IC50=(4.41±0.72)mol/m1]比对照组的IC。。也明显降低,(P<0.05),相对逆转率42.5%。转染组和Tet作用组均低于对照组对5-Fu的RI。表明shRNA干扰质粒转染细胞和Tet作用后均在一定程度恢复耐药细胞对化疗药物5-FU的敏感性,且shRNA干扰质粒对LOVO/5-Fu耐药性的逆转作用更强。2、细胞周期的变化：与对照组细胞相比,转染组和Tet作用组细胞G1期增多(P<0.05),S期减少(P<0.05)。提示抑制MDR1的表达后,更多的细胞被阻滞在Gl期,进入分裂期的细胞明显减少,转染组阻滞效果更明显。3、各组细胞凋亡率的变化：对照组细胞的凋亡率为(1.32±0.47)%,转染组细胞的凋亡率为(5.88±0.44)%,两组凋亡率间差异有显著性意义(P<0.05)；Tet作用组细胞的凋亡率为(3.24±0.26)%,与对照组细胞的凋亡率间差异有显著性意义(P<0.05)；转染组与Tet作用组细胞间的凋亡率差异有显著性意义(P<0.05)。4、P-gp表达结果：转染组细胞P-gp[(61.6±4.85)%]明显低于对照组细胞的P-gp的表达率[(96.9±2.25)%],差异具有统计学意义(P<0.05)；Tet作用组细胞P-gp表达率为(76.6±3.62)%,明显低于对照组细胞的P-gp的表达率,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染组与Tet作用组细胞间的P-gp表达率差异有统计学意义(P<0.05)。5、细胞MDRl基因的表达：转染组细胞的RQ (Relative Quantitation)值为(232.98±81.04),与对照组细胞(1462.00±161.17)相比,MDR1表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；Tet作用组细胞的RQ值为(569.99±85.15),与对照组组细胞相比,MDR1表达量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染组细胞的RQ值小于Tet作用组细胞的RQ值,两组之间比较差异有统计学意义(P<0.05)。6、Western blot检测P-gp蛋白：转染组与Tet作用组细胞的P-gp蛋白表达明显低于对照组细胞。转染组细胞的P-gp蛋白表达明显低于Tet作用组细胞的P-gp蛋白表达。说明转染靶向MDR1的shRNA干扰质粒和经过Tet作用后均可在一定程度上降低LOVO/5-FU多药耐药细胞的P-gp蛋白表达,shRNA干扰质粒对P-gp的抑制强于Tet。结论1、shRNA干扰质粒和Tet体外均能逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu的MDR。2、shRNA干扰质粒和Tet逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO/5-Fu的机制均与MDRmRNA、P-gp蛋白的下调有关。3、shRNA干扰质粒比Tet能更有效的逆转人大肠癌多药耐药细胞株LOVO／5-Fu的MDR。