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研究目的：
肿瘤相关性贫血（Cancer related anemia，CRA）是恶性肿瘤常见的伴随疾病之一。随着近年来对CRA的重视，有关CRA的流行病学和致病因素研究逐渐增多，但迄今对其发病机制尚不明确。造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells,HSCs）是一群具有自我更新、能够在体内持续产生全部血液细胞和免疫细胞能力的多能干细胞。本项目利用小鼠肺癌模型，研究肿瘤条件下造血干细胞的红系细胞分化特征，以探明此过程的可能异常变化及其潜在分子机制。
研究方法：
（1）小鼠肿瘤模型的构建：本实验均使用6~8周龄C57BL/6J雌性小鼠，以皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞（Lewis lung carcinoma,LLC）作为实验组，以皮下注射PBS为对照组，4周后用于后续实验；（2）骨髓细胞单细胞悬液的制备：断颈法处死小鼠后，用医用剪刀和镊子分离小鼠股骨与胫骨，用注射器将骨髓腔中的骨髓细胞反复冲洗至DMEM完全培养基中。（3）细胞的分选：小鼠骨髓细胞用特定组合的荧光素偶联抗体进行孵育标记，后用流式细胞分选以分选纯化特定细胞群。（4）体外细胞定向分化实验：分选特定细胞群细胞至半固体培养基中培养7~14天，对集落进行计数并对集落中细胞进行吉姆萨染色，对细胞类型镜检测定。（5）基因mRNA表达水平的检测：利用TRIzol法提取细胞的RNA，后用cDNA第一链合成试剂盒将其逆转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测。（6）统计方法：数据统计采用Prism软件进行独立样本T检验，统计结果以平均值±标准差表示。
研究结果：
（1）肿瘤条件下红细胞的变化
首先，取外周血行瑞士吉姆萨染色，镜下计数红细胞（RBC）的数量。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。同一视野下，T-RBC和N-RBC的数量分别478.0±1.155与495.7±3.333，表明肿瘤条件下红细胞数目显著降低，但同时伴有显著增多的有核红细胞。
（2）肿瘤条件下血常规分析
对正常小鼠和肿瘤小鼠外周血血常规分析。分别统计肿瘤小鼠和正常小鼠外周血中红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、红细胞压积（HCT）含量及平均红细胞体积（MCV）。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。T-RBC和N-RBC的含量分别为11.94±1.552×1012/L与23.28±1.297×1012/L。T-Hb与N-Hb的含量分别为76.00±5.891(g/L)与165.2±4.994(g/L)。T-HCT与N-HCT的含量分别为0.2652±0.01482%与0.5246±0.01639%。T-MCV与N-MCV的大小分别为57.16±1.735(fL)与45.50±0.4135(fL)。表明肿瘤条件下小鼠外周血中RBC、Hb、HCT含量均显著降低，MCV显著增大。
（3）肿瘤条件下肺癌病人外周血有核红细胞的变化
利用流式分析肿瘤病人外周血中有核红细胞（NRBC）丰度。肿瘤病人和正常人（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。结果显示，T-NRBC和N-NRBC分别为占外周血细胞的0.2308±0.08761%与0.0243±0.00408%，表明肺癌病人外周血中有核红细胞显著增多。
（4）肿瘤条件下骨髓红细胞分化通路上游不同祖细胞群丰度的变化
造血干细胞向红细胞分化的早期阶段包含多能祖细胞MPP2、共同髓系祖细胞CMP、红细胞/巨核细胞祖细胞MEP等。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。流式分析显示，T-MPP2和N-MPP2分别占骨髓细胞总数的0.0083±0.00240%和0.0023±0.00088%、T-CMP和N-CMP分别占骨髓细胞总数的0.4165±0.08738%和0.5068±0.02894%、T-MEP和N-MEP分别占骨髓细胞总数的0.3158±0.09155%和0.4160±0.06015%。结果表明，肿瘤条件下骨髓红细胞分化通路上游不同祖细胞丰度无显著性变化。
（5）肿瘤条件下骨髓和脾脏红细胞分化通路下游不同前体细胞丰度的变化
造血干细胞向红细胞分化的晚期阶段包含原红细胞（Proerythroblasts,ProE）、早幼红细胞（Basophilic erythroblasts,BasoE）、中幼红细胞（Polychromatic erythroblasts,PlyE）、晚幼红细胞（Orthochromatic erythroblasts,OrthoE）。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。流式分析显示，T-ProE和N-ProE分别占骨髓细胞总数的0.1593±0.02942%和0.0713±0.01638%。T-BasoE和N-BasoE分别占骨髓细胞总数的20.87±1.485%和27.50±0.9866%。T-Poly-E和N-Poly-E分别占骨髓细胞总数的1.041±0.2893%和1.593±0.3284%。T-OrthoE和N-OrthoE分别占骨髓细胞总数的5.390±0.8075%和16.90±1.858%。结果表明，肿瘤条件下骨髓中BasoE、OrthoE阶段细胞丰度均显著降低，说明肿瘤条件下骨髓中红细胞终末分化阶段出现障碍。在小鼠脾脏中，T-ProE和N-ProE分别占脾脏细胞总数的0.8193±0.2545%和0.0400±0.02382%。T-BasoE和N-BasoE分别占脾脏细胞总数的35.75±3.082%和1.023±0.2015%。T-Poly-E和N-Poly-E分别占脾脏细胞总数的3.150±0.5654%和0.4790±0.1042%。T-OrthoE和N-OrthoE分别占脾脏细胞总数的3.833±0.6132%和13.83±2.641%。结果显示，肿瘤小鼠脾脏中ProE、BasoE、PlyE细胞丰度均显著增加，而OrthoE细胞丰度显著降低，表明肿瘤条件下脾脏中ProE、BasoE、PlyE阶段细胞大量积累，但在红细胞终末分化也出现障碍。
（6）荷瘤小鼠不同造血祖细胞分化形成红细胞的能力
流式分选造血干细胞向红系分化通路上处于不同阶段细胞群，将分选细胞转入红系定向分化培养基中培养。7天后，测定BFU-E和CFU-E集落数量。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。T-MPP2细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为75.67±2.186和51.67±0.8819，N-MPP2细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为75.67±1.202和48.33±0.8819。T-CMP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目为20.67±1.764和56.00±0.5774。N-CMP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为17.00±3.606和54.67±1.764。T-MEP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为19.33±2.333和35.67±1.667，N-MEP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为15.67±1.453和41.67±2.963。结果表明，肿瘤小鼠造血干细胞向红细胞分化的祖细胞包括MPP2、CMP、MEP等阶段细胞的红细胞分化能力无显著性变化。
（7）肿瘤条件下骨髓红细胞分化通路下游前体细胞分化形成红细胞的能力
流式分选造血干细胞向红系分化通路下游前体细胞，将分选细胞转入红系定向分化培养基中培养。2天后，测定CFU-E集落数量。T-红细胞前体细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E的数目为3.000±0.5774，N-红细胞前体细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E的数目为48.33±2.404，表明肿瘤小鼠红细胞前体细胞分化形成红细胞能力显著降低。
（8）红细胞前体细胞体外定向红细胞分化瑞士吉姆萨染色
为明确肿瘤条件下红细胞前体细胞分化形成红细胞能力，由于红细胞分化通路下游前体细胞各阶段分选细胞数量过少，因此，分选Ter119+CD71+细胞转入红系定向分化培养基中培养。2天后，行瑞士吉姆萨染色，进一步测定肿瘤条件下红细胞分化潜能。结果显示，肿瘤小鼠来源的Ter119+CD71+与正常小鼠来源的Ter119+CD71+体外定向红细胞形成所占百分比分别为14.286%和64.286%。表明肿瘤来源的Ter119+CD71+分化形成红细胞的比例减少。
（9）肿瘤条件下红细胞前体细胞向红细胞分化调控因子筛选：
（10）正常小鼠和肿瘤小鼠红细胞前体细胞细胞中SOX6的表达
研究结论：
CRA是恶性肿瘤的常见伴随疾病。本课题利用小鼠肺癌模型研究肿瘤条件下造血干细胞的红系细胞分化特征，以探明此过程的可能异常变化及其潜在分子机制。发现，肿瘤条件下红细胞发育出现障碍，且障碍出现在红细胞终端分化阶段。这些发现对于明晰CRA疾病状态下造血干细胞向红细胞分化途径提供了新的视角。
肿瘤相关性贫血（Cancer related anemia，CRA）是恶性肿瘤常见的伴随疾病之一。随着近年来对CRA的重视，有关CRA的流行病学和致病因素研究逐渐增多，但迄今对其发病机制尚不明确。造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells,HSCs）是一群具有自我更新、能够在体内持续产生全部血液细胞和免疫细胞能力的多能干细胞。本项目利用小鼠肺癌模型，研究肿瘤条件下造血干细胞的红系细胞分化特征，以探明此过程的可能异常变化及其潜在分子机制。
研究方法：
（1）小鼠肿瘤模型的构建：本实验均使用6~8周龄C57BL/6J雌性小鼠，以皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞（Lewis lung carcinoma,LLC）作为实验组，以皮下注射PBS为对照组，4周后用于后续实验；（2）骨髓细胞单细胞悬液的制备：断颈法处死小鼠后，用医用剪刀和镊子分离小鼠股骨与胫骨，用注射器将骨髓腔中的骨髓细胞反复冲洗至DMEM完全培养基中。（3）细胞的分选：小鼠骨髓细胞用特定组合的荧光素偶联抗体进行孵育标记，后用流式细胞分选以分选纯化特定细胞群。（4）体外细胞定向分化实验：分选特定细胞群细胞至半固体培养基中培养7~14天，对集落进行计数并对集落中细胞进行吉姆萨染色，对细胞类型镜检测定。（5）基因mRNA表达水平的检测：利用TRIzol法提取细胞的RNA，后用cDNA第一链合成试剂盒将其逆转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）检测。（6）统计方法：数据统计采用Prism软件进行独立样本T检验，统计结果以平均值±标准差表示。
研究结果：
（1）肿瘤条件下红细胞的变化
首先，取外周血行瑞士吉姆萨染色，镜下计数红细胞（RBC）的数量。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。同一视野下，T-RBC和N-RBC的数量分别478.0±1.155与495.7±3.333，表明肿瘤条件下红细胞数目显著降低，但同时伴有显著增多的有核红细胞。
（2）肿瘤条件下血常规分析
对正常小鼠和肿瘤小鼠外周血血常规分析。分别统计肿瘤小鼠和正常小鼠外周血中红细胞（RBC）、血红蛋白（Hb）、红细胞压积（HCT）含量及平均红细胞体积（MCV）。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。T-RBC和N-RBC的含量分别为11.94±1.552×1012/L与23.28±1.297×1012/L。T-Hb与N-Hb的含量分别为76.00±5.891(g/L)与165.2±4.994(g/L)。T-HCT与N-HCT的含量分别为0.2652±0.01482%与0.5246±0.01639%。T-MCV与N-MCV的大小分别为57.16±1.735(fL)与45.50±0.4135(fL)。表明肿瘤条件下小鼠外周血中RBC、Hb、HCT含量均显著降低，MCV显著增大。
（3）肿瘤条件下肺癌病人外周血有核红细胞的变化
利用流式分析肿瘤病人外周血中有核红细胞（NRBC）丰度。肿瘤病人和正常人（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。结果显示，T-NRBC和N-NRBC分别为占外周血细胞的0.2308±0.08761%与0.0243±0.00408%，表明肺癌病人外周血中有核红细胞显著增多。
（4）肿瘤条件下骨髓红细胞分化通路上游不同祖细胞群丰度的变化
造血干细胞向红细胞分化的早期阶段包含多能祖细胞MPP2、共同髓系祖细胞CMP、红细胞/巨核细胞祖细胞MEP等。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。流式分析显示，T-MPP2和N-MPP2分别占骨髓细胞总数的0.0083±0.00240%和0.0023±0.00088%、T-CMP和N-CMP分别占骨髓细胞总数的0.4165±0.08738%和0.5068±0.02894%、T-MEP和N-MEP分别占骨髓细胞总数的0.3158±0.09155%和0.4160±0.06015%。结果表明，肿瘤条件下骨髓红细胞分化通路上游不同祖细胞丰度无显著性变化。
（5）肿瘤条件下骨髓和脾脏红细胞分化通路下游不同前体细胞丰度的变化
造血干细胞向红细胞分化的晚期阶段包含原红细胞（Proerythroblasts,ProE）、早幼红细胞（Basophilic erythroblasts,BasoE）、中幼红细胞（Polychromatic erythroblasts,PlyE）、晚幼红细胞（Orthochromatic erythroblasts,OrthoE）。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。流式分析显示，T-ProE和N-ProE分别占骨髓细胞总数的0.1593±0.02942%和0.0713±0.01638%。T-BasoE和N-BasoE分别占骨髓细胞总数的20.87±1.485%和27.50±0.9866%。T-Poly-E和N-Poly-E分别占骨髓细胞总数的1.041±0.2893%和1.593±0.3284%。T-OrthoE和N-OrthoE分别占骨髓细胞总数的5.390±0.8075%和16.90±1.858%。结果表明，肿瘤条件下骨髓中BasoE、OrthoE阶段细胞丰度均显著降低，说明肿瘤条件下骨髓中红细胞终末分化阶段出现障碍。在小鼠脾脏中，T-ProE和N-ProE分别占脾脏细胞总数的0.8193±0.2545%和0.0400±0.02382%。T-BasoE和N-BasoE分别占脾脏细胞总数的35.75±3.082%和1.023±0.2015%。T-Poly-E和N-Poly-E分别占脾脏细胞总数的3.150±0.5654%和0.4790±0.1042%。T-OrthoE和N-OrthoE分别占脾脏细胞总数的3.833±0.6132%和13.83±2.641%。结果显示，肿瘤小鼠脾脏中ProE、BasoE、PlyE细胞丰度均显著增加，而OrthoE细胞丰度显著降低，表明肿瘤条件下脾脏中ProE、BasoE、PlyE阶段细胞大量积累，但在红细胞终末分化也出现障碍。
（6）荷瘤小鼠不同造血祖细胞分化形成红细胞的能力
流式分选造血干细胞向红系分化通路上处于不同阶段细胞群，将分选细胞转入红系定向分化培养基中培养。7天后，测定BFU-E和CFU-E集落数量。荷瘤小鼠和正常小鼠（对照）来源细胞分别以T和N表示（以下同）。T-MPP2细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为75.67±2.186和51.67±0.8819，N-MPP2细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为75.67±1.202和48.33±0.8819。T-CMP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目为20.67±1.764和56.00±0.5774。N-CMP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为17.00±3.606和54.67±1.764。T-MEP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为19.33±2.333和35.67±1.667，N-MEP细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E和BFU-E的集落数目分别为15.67±1.453和41.67±2.963。结果表明，肿瘤小鼠造血干细胞向红细胞分化的祖细胞包括MPP2、CMP、MEP等阶段细胞的红细胞分化能力无显著性变化。
（7）肿瘤条件下骨髓红细胞分化通路下游前体细胞分化形成红细胞的能力
流式分选造血干细胞向红系分化通路下游前体细胞，将分选细胞转入红系定向分化培养基中培养。2天后，测定CFU-E集落数量。T-红细胞前体细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E的数目为3.000±0.5774，N-红细胞前体细胞体外定向红细胞分化培养集落形成中，CFU-E的数目为48.33±2.404，表明肿瘤小鼠红细胞前体细胞分化形成红细胞能力显著降低。
（8）红细胞前体细胞体外定向红细胞分化瑞士吉姆萨染色
为明确肿瘤条件下红细胞前体细胞分化形成红细胞能力，由于红细胞分化通路下游前体细胞各阶段分选细胞数量过少，因此，分选Ter119+CD71+细胞转入红系定向分化培养基中培养。2天后，行瑞士吉姆萨染色，进一步测定肿瘤条件下红细胞分化潜能。结果显示，肿瘤小鼠来源的Ter119+CD71+与正常小鼠来源的Ter119+CD71+体外定向红细胞形成所占百分比分别为14.286%和64.286%。表明肿瘤来源的Ter119+CD71+分化形成红细胞的比例减少。
（9）肿瘤条件下红细胞前体细胞向红细胞分化调控因子筛选：
（10）正常小鼠和肿瘤小鼠红细胞前体细胞细胞中SOX6的表达
研究结论：
CRA是恶性肿瘤的常见伴随疾病。本课题利用小鼠肺癌模型研究肿瘤条件下造血干细胞的红系细胞分化特征，以探明此过程的可能异常变化及其潜在分子机制。发现，肿瘤条件下红细胞发育出现障碍，且障碍出现在红细胞终端分化阶段。这些发现对于明晰CRA疾病状态下造血干细胞向红细胞分化途径提供了新的视角。