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亮氨酰-tRNA合成酶(Leucyl-tRNA synthetase,LeuRS)是细胞中专一性催化亮氨酰-tRNALeu(Leu-tRNALeu)生物合成的酶,由催化结构域、CP1编校结构域与C末端结构域等多个功能结构域组成。依据蛋白质序列的差异与结构域的编排等因素可将其细分为细菌类型与古菌/真核类型。LeuRS可以误活化与误氨基酰化多种非对应氨基酸,而其编校活力可以有效清除错误产物,保证蛋白质合成的精确性。一般在细胞质或者线粒体等单一的细胞空间内只存在一种LeuRS,且其所有结构域均为同一类型。 极端嗜盐嗜碱菌Natrialba magadii是生长于强碱性高盐条件下的古菌。它的细胞质中同时编码两种类型的LeuRS(NmLeuRS1和NmLeuRS2),而这两种NmLeuRS均是首次被发现的天然融合了细菌类型和古菌类型不同功能结构域的蛋白质;而该菌中还编码典型的古菌类型亮氨酸tRNA(NmtRNALeu)。这两种天然嵌合形式的NmLeuRS对NmtRNALeu的识别方式、作用机制和功能等都有待研究发现。 本研究中从Natrialba magadii的基因组中成功克隆了NmLeuRS1和NmLeuRS2的基因,并在大肠杆菌中诱导表达并纯化得到有活力的蛋白质。在40℃、pH9.0的饱和浓度KC1条件下,两种NmLeuRS表现出最高的氨基酰化活力。保守残基的突变与跨物种交叉识别的实验证实了两种NmLeuRS均以古菌方式识别自身NmtRNALeu,但它们N端的催化活力中心却属于细菌类型。此外,两种NmLeuRS表现出显著差异的经典活力,NmLeuRS1具有正常氨基酰化和编校活力,而NmLeuRS2仅有很低的活力;暗示了前者在体内维持经典功能的同时,后者可能是进化遗迹或者在细胞中发挥其它非经典功能。另外,NmLeuRS1可以误活化多种非对应氨基酸,主要通过依赖tRNA的转移后编校途径清除错误产物,对蛋白质合成的原料进行质量控制。以上的研究结果加深了对极端条件生长的古菌中氨基酰-tRNA合成酶与tRNA相互作用的机理、以及对蛋白质生物合成进行质量控制机理的认识。 另一项研究是关于酵母LeuRS(ScLeuRS)的编校功能的研究。aaRS的编校活力在保证蛋白质生物合成的精确性上发挥重要作用,而编校活力受损可能导致细胞内蛋白质的错误折叠,影响细胞正常生长,甚至诱发一系列的疾病。编校活力受损是如何影响细胞代谢与信号通路等问题未有研究报道。 本研究中以ScLeuRS为研究对象,发现了ScLeuRS编校不同的误氨基酰化产物的活力不同,作为非蛋白质氨基酸的正缬氨酸Nva是ScLeuRS编校反应的主要的非对应氨基酸;而专一的编校活性口袋不能有效水解少量的缬氨酰-tRNALeu。此外,Nva显著抑制了含有阻断了LeuRS转移后编校活力的突变体ScLeuRS-D419A的酵母生长,转录表达谱分析表明Nva的胁迫激活了酵母细胞内Hsp70/Hsp90基因的转录表达,暗示了Nva可能参入了蛋白质,进而影响蛋白质的正确折叠;此外Nva胁迫还影响了细胞内的糖类代谢、生物素代谢等。以上研究拓展了对aaRS催化的tRNA氨基酰化反应过程中的编校活性重要性的认识,并为aaRS编校活力缺失导致的生理疾病的治疗研究提供线索。