背景与目的:肿瘤代谢方面研究如今已成为肿瘤研究领域的热点,且肿瘤能量代谢异常和基因组不稳定及突变列入肿瘤十大特征。大多数正常分化的组织细胞在有氧条件下摄取葡萄糖通过线粒体氧化磷酸化方式,最终完全分解产生水和二氧化碳,并获取细胞生命活动所需要的能量;然而,肿瘤细胞即便是在正常的含氧环境下仍然从外周摄取大量的葡萄糖进行糖酵解反应,并以此作为肿瘤细胞重要的途径来获取能量,而不是依赖线粒体氧化磷酸化产生能量,这一现象即Warburg效应,也被称为肿瘤的有氧糖酵解。对于细胞来说,有氧糖酵解并不是高效获取ATP的手段,但糖酵解代谢的中间产物可为肿瘤细胞合成核酸、蛋白质及脂类等生物大分子提供原料。因此,这种代谢方式有利于肿瘤快速分裂增殖。近年来,异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因的突变在肿瘤中频频发现,再一次引发人们对肿瘤代谢的关注。IDH1主要位于胞浆中,以NADP+为辅酶能够结合异柠檬酸进行氧化脱羧反应,催化生成为α-酮戊二酸(α-KG),并伴随NADPH的生成。IDH1基因突变频发于人类低级别胶质瘤和部分继发性胶质母细胞瘤。突变后的IDH1改变了原有的催化功能,并且获得新的酶学功能,能够催化α-KG转变为2-羟戊二酸(2-HG),并同时消耗细胞中的NADPH。2-HG被认为是肿瘤细胞内致瘤代谢产物,能够竞争性抑制α-KG依赖性去甲基化酶(如TET2和JHDMs),使得细胞基因组中某些抑癌基因高甲基化而表达沉默。微小RNA(micro RNAs,miRNAs)是真核细胞中一类内源性的不具备编码蛋白质功能的小RNA,能够对目的基因进行转录后调节。miRNAs在包括胶质瘤在内的人类多种癌症中异常表达,并在肿瘤发生发展中起着关键的作用。近年来,研究表明表观遗传学机制,如DNA甲基化和组蛋白修饰,不仅仅调控细胞编码基因的表达,同时也调控miRNAs的表达。miR-34a作为肿瘤中重要的抑癌因子,在多数肿瘤中呈低表达,并与肿瘤的周期、分化、凋亡和代谢等活动密切相关。先前人们研究发现,miR-34a基因启动子区含有P53蛋白结合位点,并受P53蛋白调节。然而,miR-34a的宿主基因在启动子区及转录起始位点富含Cp G岛,在多种肿瘤中表现高甲基化。本研究旨在探讨IDH1突变后产生的甲基化效应,导致miR-34a启动子区P53结合位点甲基化,沉默miR-34a表达,从而影响胶质瘤细胞糖酵解和生长的机制研究。研究方法:1.人胶质瘤miRNAs基因芯片表达数据下载于中国胶质瘤协作组(CGGA)官方网站和美国肿瘤研究联盟(TCGA)官方网站提供的数据库,筛选出IDH1突变情况下胶质母细胞瘤中差异表达的miR-RNAs。2.利用慢病毒建立稳定表达IDH1突变的胶质瘤U87和U251细胞系,利用RT-PCR技术检测miR-34a在U87和U251细胞系中的相对表达量,并进一步利用亚硫酸盐处理后测序法(BSP)检测miR-34a启动子区甲基化水平。另外,通过裸鼠原位成瘤模型验证IDH1突变对胶质瘤生长影响。3.采用DNA甲基转移酶的经典抑制剂5-氮杂脱氧胞苷(5-Aza)处理含IDH1突变基因的胶质瘤细胞系,通过RT-PCR技术检测miR-34a的相对表达情况。4.利用miR-34a寡聚核苷酸链、HK2-sh-RNA敲低HK2表达和HK2抑制剂3-Br PA处理胶质瘤细胞后,检测细胞糖酵解和生长情况。5.通过CCK8细胞活性检测实验和平板克隆形成实验,检测胶质瘤细胞生长能力的变化。采用海马生物科学公司糖酵解应激检测试剂盒,在海马XF分析仪上实时检测胶质瘤细胞糖代谢能力。6.采用生物信息预测、荧光素酶报告基因实验、RT-PCR技术和Western Blot技术验证miR-34a靶向调节糖酵解途径酶(己糖激酶1、己糖激酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、乳酸脱氢酶A)。研究结果:1.CGGA和TCGA的基因表达谱芯片分析表明,与IDH1野生型人脑胶质母细胞瘤相比,miR-34a在IDH1突变型人脑胶质母细胞瘤中呈现低表达。2.在体外实验中,稳转IDH1突变型基因的细胞系中mir-34a表达降低。5-Aza处理IDH1突变型的胶质瘤U87和U251细胞系后,miR-34a表达上升。BSP结果显示IDH1突变后,miR-34a启动子区DNA甲基化水平高。3.IDH1突变促进胶质瘤细胞糖代谢、增殖和克隆形成功能,用5-Aza处理IDH1突变型细胞后糖代谢和增殖能力下降。小鼠原位成瘤模型表明,IDH1突变后可以促进肿瘤生长。4.转染miR-34a寡聚核苷酸链后,胶质瘤U87和U251细胞糖酵解、增殖和克隆形成能力下降。下调HK2后或使用HK2抑制剂(3-Br PA)后,胶质瘤细胞糖酵解水平、增殖和克隆形成能力降低。5.生物信息学预测、荧光素酶报告基因实验、RT-PCR和Western Blot技术研究表明:miR-34a直接结合糖酵解系列酶(己糖激酶1、己糖激酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、乳酸脱氢酶A)m RNA的3′UTR区调控它们的表达。利用糖酵解关键酶HK2回复实验表明,上调HK2后能够逆转miR-34a产生的抑癌效应,使得细胞糖酵解能力、增殖和克隆形成能力逆转。研究结论1、IDH1突变/miR-34a/糖酵解酶这一调控通路在IDH1突变型胶质瘤细胞的代谢和生长中发挥重要作用。IDH1作为细胞内重要的代谢酶,其突变后可通过miRNA介导调节肿瘤细胞自身有氧糖酵解。这为以后肿瘤物质代谢领域提供新的研究方向和靶点。2、IDH1突变通过启动子区甲基化沉默miR-34a。启动子区甲基化作为miR-34a基因转录水平重要调控机制,并非仅依赖P53途径调节。另外,5-Aza和3-Br PA可作为重要的小分子抑制剂,在阻碍胶质瘤的发展中起着重要作用。