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研究背景:卵巢癌的死亡率位于女性生殖系统三大恶性肿瘤的首位,其中90%为上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer,EOC）,由于其发病隐匿,70%的患者就诊时已为晚期并伴有远处转移1。一线治疗后缓解的患者中仍有55%～75%在2年内复发,导致其五年生存率不到40%2,因此探索新的治疗方法具有重要意义。1989年Gross第一次提出“嵌合受体”的概念3,即将T细胞受体的可变区用单链抗体替代,这样修饰的T细胞便具备了抗原靶向性功能。嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor modified T cells,CAR-T）的设计由此诞生,CAR-T可定向识别肿瘤细胞并具有特异性的杀伤功能。CAR基因由胞外的单链可变区（single chain variable fragment,sc Fv）和胞内的活化基序组成,经过这样修饰的T细胞解决了肿瘤细胞MHC（Major Histocompatibility Complex）I类分子丢失而产生的免疫逃逸问题,因而具有巨大的应用前景。经过近三十多年的发展,2011年开发出的第二代CAR-T在急性淋巴细胞白血病的治疗上取得了近90%的完全缓解率,开启了人类抗肿瘤历史上的新纪元,为恶性肿瘤患者带来了希望4。然而CAR-T治疗方法在实体瘤上却遭遇困境,主要面临的瓶颈有:1.实体瘤的异质性,单个靶点的CAR-T治疗后易复发（抗原逃逸）;2.实体瘤的免疫抑制微环境（缺氧、低p H、Treg细胞、吲哚胺2,3-双加氧酶）导致T细胞激活不足和/或T细胞抑制;3.T细胞的持久性不足,扩增不足;4.实体瘤具有包膜,T细胞难浸润、难归巢5-8。根据以上存在的问题,我们提出了拟解决的三个问题:1.如何减少肿瘤抗原逃逸?2.如何增加CAR-T的浸润?3.如何更有效激活CAR-T?针对第一个问题,我们经过前期生物信息学的筛选和临床样本的验证,选择了两种在EOC中高表达的肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen,TAA）:叶酸受体α（folate receptor alpha,FOLR1）和间皮素（mesothelin,MSLN）,拟构建同时靶向FOLR1和MSLN的串联型CAR-T（Tandem CAR）。既往文献报道FOLR1在EOC中有接近80%的表达率,而在正常组织中只有肾脏近曲小管、I、II型肺泡细胞、脑脉络膜等少量表达9。MSLN在EOC有近65%的高表达,而正常组织中仅腹膜、胸膜、心包膜少量表达,实质脏器几乎不表达10。因此这两种TAA满足CAR-T设计的靶向性和安全性,在此基础上我们设计了同时靶向FOLR1与MSLN的串联型CAR-T（Tandem CAR-T）,希望其能有更广的杀伤覆盖率。此外,针对CAR-T的浸润和激活问题,我们利用可分泌IL-12（interleukin-12）的第四代CAR-T载体,通过IL-12的免疫激活作用（如激活细胞毒性T细胞,募集B细胞、NK细胞、巨噬细胞等）,进一步强化肿瘤微环境中T细胞的免疫应答,CAR-T细胞的存活和扩增能力将进一步提高。研究方法:1.生物信息学筛选靶抗原,临床样本进行抗原表达的验证。2.分别构建靶向FOLR1和MSLN的第四代Tandem-CAR、FOLR1-CAR、MSLN-CAR慢病毒载体。3.免疫磁珠分选CD3细胞,慢病毒感染CD3,流式细胞检测仪检测CAR的表达。4.LDH（lactate dehydrogenase）释放实验、实时无标记细胞分析仪（RTCA,real time cell analysis）检测不同CAR-T的体外杀伤能力,流式细胞术检测共培养条件下细胞因子的分泌情况。5.利用SNU119卵巢癌细胞与重度免疫缺陷小鼠B-NDG(NOD-Prkdcscidcid IL2rgtm1/Bcgen)建立移植瘤模型,活体成像比较不同CAR-T的体内治疗效果。研究结果:1.生物信息学筛选出两种在EOC中高表达的TAA:FOLR1和MSLN,进一步临床样本分析显示FOLR1蛋白阳性表达率为80.95%（85/105）,MSLN蛋白阳性表达率为53.33%（56/105）,两者在EOC的表达均显著高于交界性卵巢癌和正常卵巢组织（P<0.001）,两种蛋白的阳性覆盖率为85.71%（90/105）。2.成功构建了Tandem-CAR、FOLR1-CAR、MSLN-CAR的慢病毒载体,经测序验证正确,包装慢病毒并感染CD3细胞,建立了不同种类的CAR-T。3.LDH实验、RTCA表明,相比于对照组和两个单靶点CAR-T,Tandem-CAR细胞能明显杀伤FOLR1和MSLN同时高表达的SNU119细胞,而对FOLR1和MSLN低表达的A2780细胞杀伤率较低。4.流式细胞检测IL-2、IL-12、TNF-α、IFN-γ水平,结果表明与SNU119细胞共培养后,Tandem-CAR释放细胞因子的阳性比例最高,三种CAR-T均成功表达了IL-12,而Mock-T细胞（未转染病毒的T细胞）几乎不表达IL-12。三种CAR-T表达IL-2、TNF-α、IFN-γ阳性细胞的比例均明显高于对照组（Mock-T）。5.小鼠实验表明相比于Mock-T组,三种CAR-T均能有效抑制肿瘤的生长,MSLN-CAR的治疗作用体现为肿瘤先缩小后增长,FOLR1-CAR和Tandem-CAR治疗组肿瘤荧光强度均持续减小。Tandem-CAR的治疗效果最为明显,其中有1例小鼠的肿瘤发生消退。结论:筛选并验证了两种在EOC中高表达的TAA,成功构建了同时靶向FOLR1和MSLN的第四代CAR-T,相较于单靶点CAR-T,Tandem-CAR在体外的杀伤效能更强,能分泌高水平的细胞因子,B-NDG小鼠荷瘤模型表明三种CAR-T在体内仍有抗肿瘤能力,Tandem-CAR在体内的治疗效果最为明显,这为减少肿瘤的免疫逃逸提供了新的思路,也为Tandem-CAR能进入临床研究提供理论基础。