论文部分内容阅读
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是临床常见的恶性肿瘤,其发病率目前有上升趋势,在亚洲,有数量非常庞大的患者正在遭受肝细胞肝癌(HCC)、尤其是乙肝和丙肝病毒感染相关HCC的痛苦。HCC侵袭性极强,预后差,因此,早期诊断、早期治疗对肝癌尤其重要。甲胎蛋白(alpha–fetoprotein, AFP)是临床上诊断HCC最常用的肿瘤标志物之一,但敏感性较低(70%左右),特异性也较低(64%),单独应用AFP诊断HCC容易造成漏诊和误诊。因此,从血浆/血清中寻找新的HCC早期诊断指标物是HCC相关研究的一大热点。本文在已有工作的基础上,以5例肝细胞肝癌(HCC)患者血浆为研究对象,选用免疫亲和色谱去除血浆中六种主要高丰度蛋白、离线反相液相色谱法预分级血浆低丰度蛋白并收集差异表达蛋白组;通过二维纳流液相色谱芯片富集、分离酶解肽混合物,线性离子阱质谱途径在线鉴定差异蛋白,为从血浆中筛选诊断HCC的新颖标志物提供了可行的技术路线。一、样本收集与处理为了研究工作具有可比性,按照HUPO(Human Proteome Organization)推荐的选取健康志愿者标准与收集处理标准选择和处理正常对照组和肝细胞肝癌患者组血浆标本。二、血浆中高丰度蛋白的去除血浆蛋白质组学面临的首要瓶颈问题之一是血浆高丰度蛋白的去除。研究工作选用曾在HUPO PPP(Plasma Proteome Project)项目中广泛使用的多重亲和去除系统[MARS(Agilent Mutiple Affinity RemoveSystem)Spin Cartridge]去除血浆中六种主要高丰度蛋白(白蛋白、结合珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白G、转铁蛋白、α-1-抗胰蛋白酶),并用Amicon Ultra-4(3 kDa)浓缩得到血浆低丰度蛋白质组。在去除HCC血浆中高丰度蛋白质组前,用一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证了MARS Spin Cartridge去除正常对照血浆高丰度蛋白的效果。对健康志愿者混合血浆和5例HCC患者血浆中MARS柱结合的高丰度蛋白和流出的低丰度蛋白Bradford法定量结果表明该方法可有效去除血浆高丰度蛋白,去除率为85%,重复性好。三、血浆低丰度蛋白质组预分级考虑到疏水性蛋白质在生物标志物中的重要性,研究工作采用反相高效液相色谱(Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography,RP-HPLC)对血浆低丰度蛋白质组进行预分级,包括:①以正常对照血浆低丰度蛋白组为样本考察并优化样本的前处理、反相色谱条件和手动收集色谱峰延迟时间;②按照优化的分离条件对正常对照血浆、HCC患者血浆低丰度蛋白组进行预分级,收集HCC血浆样本差异表达色谱峰。研究工作表明,与健康志愿者混合血浆低丰度蛋白质组的分级结果比较,HCC患者血浆低丰度蛋白质组中出现了共同高表达的色谱差异峰B,共同低表达差异峰C;1#HCC患者血浆低丰度蛋白质组中出现了特有高表达色谱峰A。四、二维纳流液相色谱芯片/离子阱质谱分析分别对研究中选择的1号HCC患者血浆低丰度蛋白质组中共同高表达色谱差异峰B、特有高表达色谱峰A进行了进一步的二维液相色谱-芯片离子阱质谱分离与分析。差异表达蛋白组经离线胰酶酶解后,采用二维液相色谱-芯片(HPLC-Chip,包含一支纳升级Zorbax 300SB-C18富集柱和一支纳升级Zorbax 300SB-C18分析柱)富集、分离肽混合物,线性离子阱质谱在线分析,以Spectrum Mill MS Proteomics Workbench自动分析MS和MS/MS数据后在UniProtKB/SWISS-PORT数据库中进行搜索,鉴定得到27种差异蛋白,其中23种蛋白与各种疾病或肿瘤相关,IMP3(Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 3)、ARNT2(Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 2)和GRIP1(Glutamate receptor-interacting protein 1)三种蛋白可能成为诊断HCC的潜在生物标志物。