论文部分内容阅读
猫作为伴侣动物,它与人类的关系极为密切。据报道,猫可以自然感染多种亚型流感病毒,包括H5N1高致病性禽流感病毒、H3N2低致病性犬流感病毒、H1N1季节性人流感病毒以及H7N2低致病性禽流感病毒。因此,猫对多种亚型流感病毒均易感的特征,使其成为一种潜在的新型流感病毒“混合器”,并为禽流感病毒形成适应哺乳动物毒株提供机会,从而增加人类大流行的风险。由此可见,对猫群中流感病毒的监测和研究具有重要意义。本研究通过对广州市部分流浪猫进行样品采集后,鉴定分离得到1株禽源H5N6亚型猫流感病毒,随后选取NCBI与GISAID数据库中H5N6亚型流感病毒的全基因组序列,通过贝叶斯等方法分析其基因特点和进化特征。结果显示:第一,该H5N6亚型猫流感病毒HA基因属于H5 2.3.4.4分支,与禽类亲缘关系近;第二,哺乳动物（人、猫和猪）H5N6亚型流感病毒分离株均与禽源流感病毒毒株呈现较近的亲缘关系,并存在一定的地域分布特征;第三,该H5N6亚型猫流感病毒HA基因存在高致病性裂解位点,NA蛋白茎部存在11个氨基酸的缺失,NS1蛋白氨基酸序列存在5个氨基酸的缺失。这表明该病毒可能为高致病性流感病毒,NA蛋白茎部氨基酸的缺失可能会影响其对宿主细胞的适应性,而NS1蛋白氨基酸的缺失可能会影响该病毒的毒力能力。接着对H5N6亚型猫流感病毒的致病性以及其与宿主细胞的互作关系进行了研究。首先,分别对鸡、小鼠和猫进行了滴鼻和气管注射两种感染方式的动物致病性实验。结果显示:该病毒对禽类和小鼠均呈现高致死率,并在禽类中出现显著的接触性传播,而对猫的临床症状仅表现在体温升高以及肺脏病理变化,在同居组中呈现血清转阳,表明其可能存在接触传播。其次,通过该病毒感染Crandell-Rees猫肾细胞（crandell-rees feline kidney,CRFK）前后差异蛋白组学分析,筛选出差异蛋白质共计373个,其中上调蛋白质有204个,下调蛋白质有169个。这些差异蛋白质主要富集于免疫相关的通路包括P13K-Akt信号通路、ECM与受体相互作、p53信号通路、PPAR信号通路和NF-κB信号通路。并通过Western-blot和q-PCR对挑选的5个差异蛋白质进行了验证。进一步也探究了 H5N6亚型猫流感病毒对宿主先天免疫应答的影响。通过构建猫IFN-β启动子双荧光素酶报告质粒系统,发现H5N6亚型猫流感病毒以及其NS1蛋白可通过阻断NF-κB或IRF3途径激活来抑制宿主IFN-β表达。之后,通过该病毒感染过表达IFN-β的细胞系从而了解IFN-β对该病毒复制的影响,研究结果表明该病毒的复制在过表达IFN-β的细胞中会受到抑制,但是当病毒先感染细胞后,再过表达IFN-β对病毒的复制则无显著影响。综上所述,首先,本研究分离得到1株H5N6亚型猫流感病毒,并分析了该病毒遗传进化特点,发现其HA基因属于H5 2.3.4.4分支,其他内部基因主要来自H5、H6和H9N2/H7N9来源分支,并且NS1蛋白存在5个氨基酸的缺失;其次,了解了该病毒对禽类及哺乳动物致病性特点,发现其对鸡和小鼠均呈现高致死率,感染猫后却呈现温和的临床反应;然后,获得了该病毒感染CRFK细胞前后差异蛋白组学的表达谱,发现差异蛋白质在与免疫相关通路上显著富集,这表明病毒感染引起了宿主强烈的免疫反应;最后,研究了该病毒对宿主IFN-β应答互作关系的研究,发现该病毒及其NS1蛋白均可以通过NF-κB和IRF3通路来抑制IFN-β启动子激活,从而阻断IFN-β的表达,同时IFN-β过表达也能抑制该病毒的复制水平。以上研究结果为宿主感染H5N6亚型猫流感病毒后的先天免疫应答及抗病毒研究提供理论依据,同时也对药物治疗时选择合理有效的时间具有一定参考意义。