研究背景:原发性肝癌是全世界第二大癌症死亡原因。美国癌症协会发表2018年癌症统计,统计显示,过去25年来美国总的癌症死亡率下降了25%,肝癌的死亡率却在上升。据统计,全球每年约有70万新发肝癌患者和60万患者死于肝癌,而中国每年超过30万人死于肝癌,占全球肝癌死亡人数的一半左右。肝癌恶性程度高,预后极差,目前手术切除仍是治疗肝癌的有效方法,但远期疗效仍欠佳,因此,寻找高效低毒的药物是治疗肝癌的有效手段之一。人们认为肿瘤的发生、发展不仅是细胞增殖失控和分化异常的结果,同时与肿瘤细胞凋亡失衡有关。然而,随着分子生物学的发展,凋亡并非是决定细胞死亡命运的唯一因素。近年,细胞自噬被证实与凋亡共同调控细胞死亡。某些情况下,自噬抑制凋亡,但自噬本身也会诱发细胞死亡,或与凋亡共同作用及在凋亡缺陷的情况下作为备份机制诱导细胞死亡。Apoptin是一种具有特异性诱导肿瘤细胞凋亡作用的蛋白质。因该蛋白不依赖于p53蛋白介导,也不被Bcl-2的过表达所抑制,故被视为新型的抗肿瘤生物蛋白。但Apoptin的自噬激活作用及与细胞凋亡的相互作用尚未被精确地阐明。研究目的:利用本课题组在先前研究中已构建的以人5型腺病毒为载体表达apoptin蛋白的重组病毒Ad-apoptin,分析研究apoptin介导的人原发性肝癌HepG-2细胞杀伤作用的主要途径和自噬激活的作用及其与细胞凋亡的相互作用关系,为apoptin的进一步研究和开发提供理论依据。研究方法:1.通过结晶紫染色、MTS检测以及建立荷瘤和转移瘤模型等实验方法,分析了apoptin对人原发性肝癌HepG-2细胞的杀伤和抑制作用。2.通过 Hoechst 染色、AnnexinV-FITC/PI 流式检测、qPCR 和 Western blot 检测、JC-1染色和TMRM染色等实验方法,分析了 apoptin抑制人原发性肝癌HepG-2细胞的主要方式途径。3.通过LTR染色、qPCR和Western blot检测等实验方法,分析了 apoptin抑制人原发性肝癌HepG-2细胞时自噬对apoptin的细胞抑制作用的影响。4.利用凋亡抑制剂QVD和自噬抑制剂CQ,并通过对凋亡和自噬的多种染色、对线粒体的染色、Annexin V-FITC/PI流式检测、qPCR和Western blot检测等实验方法,分析了 apoptin抑制人原发性肝癌HepG-2细胞时凋亡和自噬之间的相互关系。5.利用活性氧抑制剂NAC,并通过活性氧检测、Annexin V-FITC/PI流式检测、qPCR和Western blot检测等实验方法,分析了 ROS水平对原发性肝癌细胞凋亡和自噬的影响。研究结果:1.Apoptin具有对人原发性肝癌HepG-2细胞的体内外杀伤和抑制作用。2.Apoptin主要以内源性凋亡途径抑制人原发性肝癌HepG-2细胞的生长。3.Apoptin在抑制HepG-2细胞生长的同时会影响细胞自噬的变化,且抑制自噬能够增加HepG-2细胞的死亡率。4.Apoptin作用的HepG-2细胞中,抑制凋亡可显著降低细胞的自噬水平,且整体抑制效果在12 h大于24 h,48 h效果最为明显;而抑制自噬能够提高apoptin诱导HepG2细胞产生的凋亡作用,24 h时效果最为明显。5.Apoptin在HepG-2细胞中会显著影响活性氧水平的变化,其与细胞凋亡和自噬关系密切,且活性氧水平越高受自噬和凋亡的影响越大;抑制活性氧可有效的降低apoptin对HepG-2细胞的凋亡作用,且凋亡作用越强,抑制效果越明显;apoptin 作用的HepG-2细胞中,抑制活性氧可显著降低细胞的自噬水平,且整体降低效果在12 h大于24 h,48 h效果最为显著。研究结论:Apoptin可显著抑制人原发性肝癌HepG-2细胞的生长,主要以细胞凋亡方式引起HepG-2细胞死亡,同时引发细胞自噬。在整个过程中自噬所起到的作用以保护性作用为主,而在凋亡水平处在最高时,凋亡作用可能超过了自噬所起到的保护作用的阈值,导致自噬处在了最低水平。Apoptin可能在诱导HepG-2细胞凋亡的同时产生了线粒体自噬现象。HepG-2细胞自噬和凋亡均导致线粒体ROS水平的变化。因此,本研究认为ROS可作为通过线粒体将自噬和细胞凋亡联系起来的关键因素。创新点:1.确定了 apoptin对肝癌HepG2细胞产生的凋亡作用所通过的主要途径。2.明确了 apoptin在抑制肝癌HepG2细胞的进程中对细胞自噬产生的影响。3.分析了 apoptin诱导肝癌HepG2细胞凋亡时,自噬和凋亡作用之间的相互作用关系。4.确定了 ROS在apoptin诱导肝癌HepG2细胞死亡时,对细胞凋亡和自噬的作用。