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目的：第一部分：探讨大鼠脑微血管内皮细胞和周细胞的分离、培养方法和鉴定。第二部分：探讨褪黑素(Melatonin, Mel)通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)-9的表达和活性,来保护血管内皮细胞屏障功能的作用机制。方法：第一部分：取3周龄Wistar大鼠,无菌分离脑组织,采用两次酶消化和一次密度梯度离心法分离大鼠脑微血管片段后,通过不同的处理方法,接种于35mm培养皿上进行原代培养；使用vWF和GFAP抗体来鉴定脑微血管内皮细胞,免疫荧光染色观察紧密连接蛋白claudin-5在细胞间的分布；使用α-SMA、NG2、vWF和GFAP抗体来鉴定周细胞,利用MTT法测定周细胞的增殖。第二部分：原代分离培养人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs),并使用包被小鼠抗人CD31单克隆抗体的免疫磁珠对原代分离的HUVECs进一步纯化。以小鼠抗人vWF单克隆抗体及FITC标记的山羊抗小鼠荧光二抗鉴定纯化后的HUVECs。RT-PCR和Western blot检测不同干预条件下MMP-9、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2mRNA和蛋白表达；明胶酶谱分析不同干预条件下MMP-9和MMP-2的活性；利用Transwell系统,检测不同干预条件下透过单层内皮的Na-F来反映MMP-9对内皮通透性的影响；用免疫荧光显微镜观察不同干预条件下内皮细胞黏着连接蛋白VE-钙粘素(VE-cadherin)和紧密连接蛋白occludin、 claudin-5和ZO-1的变化以及核转录因子p65核转位；使用Western blot检测VE-cadherin、occludin和p65的表达变化。结果：第二部分：成功分离培养原代脑微血管内皮细胞和周细胞,倒置显微镜下内皮细胞呈梭形,汇合后形成典型的“鹅卵石”样外观,并通过免疫荧光染色,GFAP表达阴性,vWF表达阳性,证实为微血管内皮细胞；同时也可以看到claudine-5连续完整表达在细胞边缘；倒置显微镜下周细胞胞体大,且表现出很多的突触,并通过免疫荧光染色证实为微血管周细胞。原代周细胞初始生长速度较缓慢,传代细胞36-60h进入对数生长期,72-108h进入平台期。第二部分：(1)分离培养原代HUVECs,免疫磁珠筛选后能继续贴壁生长并传代,倒置显微镜下HUVECs呈鹅卵石状,vWF免疫荧光染色证实细胞确为HUVECs。细胞呈梭形、圆形或多角形。(2)与对照组相比,IL-1β (10ng/mL)处理组显著增加了MMP-9mRNA和蛋白的表达(P<0.001),同时TIMP-1mRNA和蛋白的表达显著减少(P<0.001),而MMP-2和TIMP-2mRNA和蛋白的表达没有明显变化(P>0.05)；与IL-1p处理组相比,Mel (10μmol/L)预处理组显著抑制了MMP-9mRNA和蛋白的表达(P<0.001),而TIMP-1mRNA和蛋白的表达显著增加(P<0.001),MMP-2和TIMP-2mRNA和蛋白的表达没有明显变化(P>0.05)；(3)明胶酶谱分析,与对照组相比,IL-1p处理组的MMP-9酶活性显著增加(P<0.001)；与IL-1β处理组相比,Mel预处理显著抑制了MMP-9酶活性(P<0.01)。然而,与对照组相比,IL-1β处理组和Mel预处理组的MMP-2酶活性无显著差异(P>0.05)。(4)Transwell分析内皮细胞屏障对Na-F的通透性的变化,与对照组相比,IL-1p处理组在不同的时间点显著增加了内皮屏障对Na-F的通透性(P<0.001)。而与IL-1p处理组相比,褪黑素预处理组显著降低了Na-F的通透性(P<0.001)。(5)荧光显微镜观察：正常汇合后的内皮细胞表达VE-cadherin、occludin、claudin-5和ZO-1呈现出连续不间断的状态；IL-1β处理组细胞之间黏附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白occludin、 claudin-5和ZO-1在细胞膜上的表达下调,并出现断裂。Mel(10μmol/L)预处理后,VE-cadherin、occludin、claudin-5和ZO-1的表达状态得到了改善。Western Blot结果表明：与对照组相比,IL-1β处理组HUVECs的VE-cadherin和occludin表达量下调。Mel可有效抑制MMP-9导致的VE-cadherin和occludin下调,但仍低于对照组(P<0.01)。(6) Western blot和免疫荧光分析,IL-1β处理组可显著增加NF-KB/p65核转位。Mel(10μmol/L)预处理组可以有效抑制这一效应。结论：第一部分：成功分离出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞和周细胞；第二部分：(1)MMP-9破坏了HUVECs黏附连接蛋白VE-cadherin和紧密连接蛋白occludin、claudin-5和ZO-1,使其表达降低,细胞间出现缝隙,通透性升高；(2)Mel通过抑制IL-1β诱导的NF-κB/p65信号转导,抑制了MMP-9活性和表达的增加,改善了内皮细胞黏着连接和紧密连接的状态,保护了内皮细胞屏障功能。